реконструированные яйцеклетки культивировали in vitro до стадии

бластоцисты и пересаживали в матку самок. Из 16-ти пересаженных бластоцист три

развились во взрослых животных. В следующей работе (1982) эти же авторы

использовали в качестве доноров ядер клетки эмбрионов еще более поздних стадий

(7 суток) и будто бы получили трех половозрелых мышей. Однако никто из

работающих в том же направлении не смог добиться подобных результатов, и

достоверность данных Илменси и Хоппе была вновь поставлена под сомнение.

МакГрат и Солтер показали, что ядра 8-клеточных зародышей и клеток внутренней

клеточной массы бластоцисты не обеспечивают развитие in vitro

реконструированных яйцеклеток даже до стадии морулы, которая предшествует стадии

бластоцисты. Небольшая часть (5%) ядер 4-клеточных зародышей дает возможность

развиваться только до стадии морулы. В то же время 19% реконструированных

яйцеклеток, содержащих ядра 2-клеточных зародышей, смогли достичь стадии морулы

или бластоцисты.

Эти и многие другие данные показывают, что в эмбриогенезе у мышей клеточные

ядра рано теряют тотипотентность, что связано, очевидно, с очень ранней

активацией генома зародыша - уже на стадии 2-х клеток. У других

млекопитающих, в частности, у кроликов, овец и крупного рогатого скота,

активация первой группы генов в эмбриогенезе происходит позднее, на 8-16-

клеточной стадии. Возможно поэтому первые значительные успехи в клонировании

эмбрионов были достигнуты на других видах млекопитающих, а не на мышах. Тем

не менее, работы с мышами, несмотря на их непростую судьбу, значительно

расширили наши представления о методологии клонирования млекопитающих.

Кролики, коровы и свиньи

Американские исследователи Стик и Робл, используя методику МакГрата и

Солтера, получили 6 живых кроликов, пересадив ядра 8клеточных эмбрионов одной

породы в лишенные ядра яйцеклетки кроликов другой породы. Фенотип родившихся

полностью соответствовал фенотипу донора.

Однако только 6 из 164 реконструированных яйцеклеток (3,7%) развились в

нормальных животных. Это, конечно, очень низкий выход, практически не

позволяющий рассчитывать на получение таким методом клона генетически

идентичных животных. Ценность этой работы, тем не менее, в том, что она

показала возможность клонирования эмбрионов кроликов.

Работа с реконструированными яйцеклетками крупных домашних животных, коров или

овец, идет несколько по-другому. Их сначала культивируют не in vitro, a

in vivo - в перевязанном яйцеводе овцы - промежуточного (первого)

реципиента. Затем их оттуда вымывают и трансплантируют в матку окончательного

(второго) реципиента - коровы или овцы соответственно, где их развитие

происходит до рождения детеныша. Уиладсин предложил заключать

реконструированные яйцеклетки в агаровый цилиндр, который он затем

трансплантировал в перевязанный яйцевод овцы. По данным одних авторов

реконструированные зародыши лучше развиваются в яйцеклетке, чем в культуральной

среде, хотя некоторые исследователи получили неплохие результаты и при

культивировании.

Американцы Робл и его сотрудники, используя щадящий метод извлечения ядра без

прокалывания мембраны яйцеклетки, предложенный МакГратом и Солтером,

пересаживали в зиготы так называемые кариопласты - мужской и женский

пронуклеусы вместе с окружающей их цитоплазмой, а также ядра 2-, 4- или 8-

клеточных эмбрионов коровы. Сначала зиготы центрифугировали, чтобы освободить

пронуклеусы от окружающих их гранул желтка, после чего ядра были хорошо видны

под микроскопом, что значительно облегчало их удаление. При помощи

манипулятора и заостренной стеклянной микропипетки извлекали один из

бластомеров вместе с ядром из ранних зародышей и переносили его в

энуклеированную зиготу.

Реконструированные зародыши были заключены в агаровый цилиндр и пересажены в

перевязанный яйцевод овцы. Через пять дней культивирования их вымывали,

освобождали от агара и исследовали. Реконструктурированные зародыши в этой

работе развивались только в тех случаях, когда в зиготы пересаживали

пронуклеусы: 17% таких зародышей достигли стадии морулы или бластоцисты. Два

зародыша были пересажены второму реципиенту - в матку коровы, и развитие их

завершилось рождением живых телят. Если в качестве доноров использовали ядра

2-, 4- или 8-клеточных зародышей, то реконструированные яйцеклетки не

развивались даже до стадии морулы.

Позже были и более успешные работы. Уиладсин, в частности, сообщил, что ему

удалось получить четырех генетически идентичных бычков холстейнской породы в

результате пересадки в реципиентные яйцеклетки ядер бластомеров одного 32-

клеточного зародыша (рис. 3). Автор утверждал, что большинство ядер

сохраняет тотипотентность на 32-клеточной стадии, а значительная их часть

даже на 64-клеточной стадии, обеспечивая нормальное развитие

реконструированных яйцеклеток до стадии ранней бластоцисты в яйцеводе овцы.

После пересадки в матку коров - окончательных реципиентов, как полагает

автор, они могут и дальше нормально развиваться.

Бондиоли и соавторы, используя в качестве доноров ядер 16-64-клеточные

зародыши коров, трансплантировали 463 реконструированных зародыша в матку

синхронизированных реципиентов, и было получено 92 живых теленка. Семь из них

были генетически идентичны, представляя собой клон, полученный в результате

пересадки ядер клеток одного донорского эмбриона.

Таким образом, клеточные ядра зародышей крупного рогатого скота достаточно

долго сохраняют тотипотентность и могут обеспечить полное развитие

реконструированных яйцеклеток. Иначе говоря, методические трудности

клонирования зародышей крупного рогатого скота практически решены. Но

остается основная задача - найти донорские ядра, обладающие тотипотентностью,

для клонирования взрослых животных.

Клонированию эмбрионов свиней посвящена только одна небольшая работа.

Скудность данных, видимо, и связана с определенными трудностями работы с этим

объектом.

Клонирование овец

Уиладсин еще в 1986 году показал, что и у эмбрионов овец на 16-клеточной

стадии развития ядра сохраняют тотипотентность. Реконструированные

яйцеклетки, содержащие ядра бластомеров 16-клеточных зародышей, развивались

нормально до стадии бластоцисты в перевязанном яйцеводе овцы (в агаровом

цилиндре), а после освобождения от агара и пересадки в матку овцы - второго

реципиента - еще 60 дней. В другом случае донорами служили ядра 8-клеточных

зародышей и были получены 3 живых ягненка, фенотип которых соответствовал

породе овец - доноров.

В 1989 году Смит и Уилмут трансплантировали ядра клеток 16-клеточного эмбриона и

ранней бластоцисты в лишенные ядра неоплодотворенные яйцеклетки овец. В первом

случае было получено два живых ягненка, фенотип которых соответствовал породе

овец - доноров ядер. Во втором случае один полностью сформировавшийся ягненок

погиб во время родов. Его фенотип также соответствовал породе - донору. Авторы

считали, что в ходе дифференцировки эмбриональных клеток происходит инактивация

некоторых важных для развития генов, в результате которой ядра бластоцисты уже

не могут репрограммироваться в цитоплазме яйцеклетки и обеспечить нормальное

развитие реконструированного зародыша. Поэтому, по мнению авторов, в качестве

доноров ядер лучше использовать 16-клеточные эмбрионы или культивируемые in

vitro линии эмбриональных клеток, ядра которых обладают тотипотентностью.

Позднее, в 1993-1995 годах, группа исследователей под руководством Уилмута

получила клон овец - 5 идентичных животных, донорами ядер которых была культура

эмбриональных клеток. Клеточную культуру получали следующим образом: выделяли

микрохирургически эмбриональный диск из 9-дневного овечьего эмбриона

(бластоцисты) и культивировали клетки in vitro в течение многих

пассажей (по крайней мере до 25). Сначала клеточная культура напоминала

культуру стволовых недифференцированных эмбриональных клеток, но вскоре, после

2-3-х пассажей, клетки становились уплотненными и морфологически сходными с

эпителиальными. Эта линия клеток из 9-дневного зародыша овцы была обозначена

как TNT4.

Чтобы донорское ядро и реципиентная цитоплазма находились на сходных стадиях

клеточного цикла, останавливали деление культивируемых клеток TNT4 на

определенной стадии (GO) и ядра этих клеток пересаживали в энуклеированные

яйцеклетки (соответственно на стадии метафазы II). Реконструированные

эмбрионы заключали в агар и трансплантировали в перевязанные яйцеводы овец.

Через 6 дней эмбрионы вымывали из яйцевода первого реципиента и исследовали

под микроскопом. Отбирали те, которые достигли стадии морулы или бластоцисты

и пересаживали их в матку овцы - окончательного реципиента, где развитие

продолжалось до рождения. Родилось 5 ягнят (самок) из них 2 погибли вскоре

после рождения, 3-й в возрасте 10 дней, а 2 оставшихся нормально развивались

и достигли 8-9-месячного возраста. Фенотипически все ягнята были сходны с

породой овец, от которой получали исходную линию клеток TNT4. Это подтвердил

и генетический анализ.

Эта работа, особенно в части культуры эмбриональных клеток, - значительное

достижение в клонировании млекопитающих, хотя она и не вызвала столь шумного

интереса, как статья того же Уилмута с соавторами, опубликованная в начале 1997

года, где сообщалось, что в результате использования донорского ядра клетки

молочной железы овцы было получено клональное животное - овца по кличке Долли.

Последняя работа методически во многом повторяет предыдущее исследование 1996

года, но в ней ученые использовали не только эмбриональные, но еще и

фибробластоподобные клетки (фибробласты - клетки соединительной ткани) плода и

клетки молочной железы взрослой овцы. Клетки молочной железы получали от

шестилетней овцы породы финн дорcет, находящейся на последнем триместре

беременности. Все три типа клеточных культур имели одинаковое число хромосом -

54, как обычно у овец. Эмбриональные клетки использовали в качестве доноров

ядер на 7-9-м пассажах культивирования, фибробластоподобные клетки плода - на

4-6-м пассажах и клетки молочной железы - на 3-6-м пассажах. Деление клеток

всех трех типов останавливали на стадии GO и ядра клеток пересаживали в

энуклеированные ооциты (яйцеклетки) на стадии метафазы II. Большинство

реконструированных эмбрионов сначала культивировали в перевязанном яйцеводе

овцы, но некоторые и in vitro в химически определенной среде.

Коэффициент выхода морул или бластоцист при культивировании in vitro в

одной серии опытов был даже вдвое выше, чем при культивировании в яйцеводе.

(Поэтому, видимо, нет строки необходимости в промежуточном реципиенте и можно

обойтись культивированием in vitro. Однако для полной уверенности в

этом нужны дополнительные данные.)

Выход морул или бластоцист в серии опытов с культурой клеток молочной железы

был примерно втрое меньше, чем в двух других сериях, когда в качестве доноров

ядер использовали культуру фибробластов плода или эмбриональных клеток. Число

живых ягнят в сравнении с числом пересаженных в матку окончательного

реципиента морул или бластоцист было также в два раза ниже. В серии опытов с

клетками молочной железы из 277 реконструированных яйцеклеток был получен

только один живой ягненок, что говорит об очень низкой результативности

такого рода экспериментов (0,36%). Анализ генетических маркеров всех семи

родившихся в трех сериях экспериментов живых детенышей показал, что клетки

молочной железы были донорами ядер для одного, фибробласты плода - для двух и

эмбриональные клетки - четырех ягнят. Овца по кличке Долли развилась из

реконструированной яйцеклетки, донором ядра которой была культивируемая

клетка молочной железы овцы породы финн дорсет и фенотипически не отличается

от овец этой породы, но сильно отличается от овцы-реципиента (рис. 4). Анализ

генетических маркеров подтвердил этот результат.

Успех авторов этой работы, прежде всего, связан с использованием длительных

клеточных культур, так как после многих пассажей в культуре клеток могли быть

отобраны малодифференцированные стволовые клетки, которые, вероятно, и были

использованы как доноры ядер. Большое значение также имел тот факт, что

авторы, учитывая результаты своих предыдущих работ, синхронизировали стадии

клеточного цикла яйцеклеток реципиентов и клеток доноров.

Но вернёмся к клонированию человека. Существует несколько способов обойти

этические проблемы – выращивать отдельные органы из клеток реципиента или

использовать животных. Но это только "косметический" метод. Реальный шаг к

бессмертию - искусственное изменение ДНК. В июне 2000 года и случилось то,

чего так долго ждали и чего некоторые так боялись. Появилось сообщение, что

ученым из уже знаменитой своей овцой Долли шотландской фирмы PPL Therapeutics

Страницы: 1, 2, 3