десятков до десятков тысяч раз) и высокая разрешающая способность.

Электронная микроскопия по методу замораживания — скалывания применяется

для изучения деталей строения мембран и межклеточных соединений. Для

изготовления сколов клетки замораживают при низкой температуре (—160°С). При

исследовании мембраны плоскость скола проходит через середину бислоя липидов.

Далее на внутренние поверхности полученных половинок мембран напыляют металлы

(платина, палладий, уран), изучают их с помощью ТЭМ и микрофотографии.

Метод криоэлектронной микроскопии. Быстро замороженный тонкий слой (около

100 нм) образца ткани помещают на микроскопическую решетку и исследуют в

вакууме микроскопа при -160°С.

Метод электронной микроскопии «замораживание — травление» применяют для

изучения внешней поверхности мембран клеток. После быстрого замораживания

клеток при очень низкой температуре блок раскалывают лезвием ножа. Образующиеся

кристаллы льда удаляют путем возгонки воды в вакууме. Затем участки клеток

оттеняют, напыляя тонкую пленку тяжелого металла (например, платины). Метод

позволяет выявлять трехмерную организацию структур.

Таким образом, методы замораживания — скалывания и замораживания — травления

позволяют изучать нефиксированные клетки без образования в них артефактов,

вызываемых фиксацией.

Методы контрастирования солями тяжелых металлов позволяют исследовать в

электронном микроскопе отдельные макромолекулы — ДНК, крупных белков

(например, миозин). При негативном контрастировании изучают агрегаты

макромолекул (рибосомы, вирусы) либо белковые филаменты (актиновые нити).

Электронная микроскопия ультратонких срезов, полученных методом

криоулътра-микротомии. При этом методе кусочки тканей без фиксации и

заливки в твердые среды быстро охлаждают в жидком азоте при температуре —196

°С. Это обеспечивает торможение метаболических процессов клеток и переход воды

из жидкой фазы в твердую. Далее блоки режут на ультрамикротоме при низкой

температуре. Такой метод приготовления срезов обычно используют для определения

активности ферментов, а также для проведения иммунохимических реакций. Для

выявления антигенов применяют антитела, связанные с частицами коллоидного

золота, локализацию которого легко выявить на препаратах.

Методы сверхвысоковольтной микроскопии. Используют электронные микроскопы

с ускоряющим напряжением до 3 000 000 В. Преимущество этих микроскопов в том,

что они позволяют исследовать объекты большой толщины (1—10 мкм), так как при

высокой энергии электронов они меньше поглощаются объектом. Стереоскопическая

съемка позволяет получать информацию о трехмерной организации внутриклеточных

структур с высоким разрешением (около 0,5 нм).

Рентгеноструктурный анализ. Для изучения структуры макромолекул на

атомарном уровне применяют методы с использованием рентгеновских лучей, имеющих

длину волны около 0,1 нм (диаметр атома водорода). Молекулы, образующие

кристаллическую решетку, изучают с помощью дифракционных картин, которые

регистрируют на фотопластинке в виде множества пятен различной интенсивности.

Интенсивность пятен зависит от способности различных объектов в решетке

рассеивать излучение. Положение пятен в дифракционной картине зависит от

положения объекта в системе, а их интенсивность свидетельствует о его

внутренней атомной структуре.

Методы исследования фиксированных клеток и тканей

Исследование фиксированных клеток и тканей. Основным объектом

исследования являются гистологические препараты, приготовленные из

фиксированных структур. Препарат может представлять собой мазок (например,

мазок крови, костного мозга, слюны, цереброспинальной жидкости и др.),

отпечаток (например, селезенки, тимуса, печени), пленку из ткани (например,

соединительной или брюшины, плевры, мягкой мозговой оболочки), тонкий срез.

Наиболее часто для изучения используется срез ткани или органа. Гистологические

препараты могут изучаться без специальной обработки. Например, приготовленный

мазок крови, отпечаток, пленка или срез органа могут сразу рассматриваться под

микроскопом. Но вследствие того, что структуры имеют слабый контраст, они плохо

выявляются в обычном световом микроскопе и требуется использование специальных

микроскопов (фазово-контрастные и др.). Поэтому чаще применяют специально

обработанные препараты.

Процесс изготовления гистологического препарата для световой и электронной

микроскопии включает следующие основные этапы: 1) взятие материала и его

фиксация, 2) уплотнение материала, 3) приготовление срезов, 4) окрашивание или

контрастирование срезов. Для световой микроскопии необходим еще один этап —

заключение срезов в бальзам или другие прозрачные среды (5). Фиксация

обеспечивает предотвращение процессов разложения, что способствует сохранению

целостности структур. Это достигается тем, что взятый из органа маленький

образец либо погружают в фиксатор (спирт, формалин, растворы солей тяжелых

металлов, осмиевая кислота, специальные фиксирующие смеси), либо подвергают

термической обработке. Под действием фиксатора в тканях и органах происходят

сложные физико-химические изменения. Наиболее существенным из них является

процесс необратимой коагуляции белков, вследствие которого жизнедеятельность

прекращается, а структуры становятся мертвыми, фиксированными. Фиксация

приводит к уплотнению и уменьшению объема кусочков, а также к улучшению

последующей окраски клеток и тканей.

Уплотнение кусочков, необходимое для приготовления срезов, производится

путем пропитывания предварительно обезвоженного материала парафином,

целлоидином, органическими смолами. Более быстрое уплотнение достигается

применением метода замораживания кусочков, например в жидкой углекислоте.

Приготовление срезов производится на специальных приборах — микротомах

(для световой микроскопии) и ультрамикротомах (для электронной

микроскопии).

Окрашивание срезов (в световой микроскопии) или напыление их солями металлов (в

электронной микроскопии) применяют для увеличения контрастности изображения

отдельных структур при рассматривании их в микроскопе. Методы окраски

гистологических структур очень разнообразны и выбираются в зависимости от задач

исследования. Гистологические красители подразделяют на кислые, основные и

нейтральные. В качестве примера можно привести наиболее известный основной

краситель азур II, который окрашивает ядра в фиолетовый цвет, и кислый

краситель — эозин, окрашивающий цитоплазму в розово-оранжевый цвет.

Избирательное сродство структур к определенным красителям обусловлено их

химическим составом и физическими свойствами. Структуры, хорошо окрашивающиеся

кислыми красителями, называются оксифильными (ацидофильными,

эозинофильными), а окрашивающиеся основными — базофильными. Структуры,

воспринимающие как кислые, так и основные красители, являются

нейтрофилъными (гетерофильными). Окрашенные препараты обычно обезвоживают в

спиртах возрастающей крепости и просветляют в ксилоле, бензоле, толуоле или

некоторых маслах. Для длительного сохранения обезвоженный гистологический срез

заключают между предметным и покровным стеклами в канадский бальзам или другие

вещества. Готовый гистологический препарат может быть использован для изучения

под микроскопом в течение многих лет. Для электронной микроскопии срезы,

полученные на ультрамикротоме, помещают на специальные сетки, контрастируют

солями марганца, кобальта и др., после чего просматривают в микроскопе и

фотографируют. Полученные микрофотографии служат объектом изучения наряду с

гистологическими препаратами.

Методы исследования химического состава и метаболизма клеток и тканей

Для изучения химического состава биологических структур — локализации

веществ, их концентрации и динамики в процессах метаболизма применяют

специальные методы исследования.

Цито- и гистохимические методы. Эти методы позволяют выявлять локализацию

различных химических веществ в структурах клеток, тканей и органов — ДНК,

РНК, белков, углеводов, липидов, аминокислот, минеральных веществ, витаминов,

активность ферментов. Эти методы основаны на специфичности реакции между

химическим реактивом и субстратом, входящим в состав клеточных и тканевых

структур, и окрашивании продуктов химических реакций. Для повышения

специфичности реакции часто применяют ферментативный контроль. Например, для

выявления в клетках рибонуклеиновой кислоты (РНК) часто используют

галлоцианин — краситель с основными свойствами, а наличие РНК подтверждают

контрольной обработкой рибонуклеазой, расщепляющей РНК. Галлоцианин

окрашивает РНК в сине-фиолетовый цвет. Если срез предварительно обработать

рибонуклеазой, а затем окрасить галлоцианином, то отсутствие окрашивания

подтверждает наличие в структуре рибонуклеиновой кислоты. Описание

многочисленных цито- и гистохимических методов дается в специальных

руководствах.

В последние годы сочетание гистохимических методов с методом электронной

микроскопии привело к развитию нового перспективного направления —

электронной гистохимии. Этот метод позволяет изучать локализацию различных

химических веществ не только на клеточном, но и на субклеточном и

молекулярном уровнях. Для изучения макромолекул клеток используют очень

чувствительные методы с применением радиоактивных изотопов и антител,

позволяющие обнаружить даже небольшое содержание молекул (менее 1000).

Радиоактивные изотопы при распаде ядра испускают заряженные частицы (электроны)

или излучение (например, гамма-лучи), которые можно зарегистрировать в

специальных приборах. Радиоактивные изотопы используют в методе

радиоавтографии. Например, с помощью радиоизотопов 3Н-тимидина

исследуют ДНК ядра, с помощью 3Н-уридина — РНК.

Метод радиоавтографии. Этот метод дает возможность наиболее полно изучить обмен

веществ в разных структурах. В основе метода лежит использование радиоактивных

элементов (например, фосфора — 32Р, углерода — 14С,

серы — 35S, водорода — 3H) или меченных ими соединений.

Радиоактивные вещества в гистологических срезах обнаруживают с помощью

фотоэмульсии, которую наносят на препарат и затем проявляют. В участках

препарата, где фотоэмульсия соприкасается с радиоактивным веществом, происходит

фотореакция, в результате которой образуются засвеченные участки (треки). Этим

методом можно определять, например, скорость включения меченых аминокислот в

белки, образование нуклеиновых кислот, обмен йода в клетках щитовидной железы и

др.

Методы иммунофлюоресцентного анализа. Применение антител. Антитела —

защитные белки, вырабатываемые плазмоцидами (производными В-лимфоцитов) в ответ

на действие чужеродных веществ (антигенов). Количество различных форм антител

достигает миллиона. Каждое антитело имеет участки для «узнавания» молекул,

вызвавших синтез этого антитела. В связи с высокой специфичностью антител в

отношении антигенов они могут быть использованы для выявления любых белков

клетки. Для выявления локализации белков антитела окрашивают флюоресцирующими

красителями, а затем клетки изучают с помощью флюоресцентной микроскопии.

Антитела можно использовать также для изучения антигенов на ультраструктурном

уровне с помощью электронного микроскопа. Для этого антитела метят

электронно-плотными частицами (микросферы коллоидного золота). Для усиления

специфичности реакции применяют моноклональные антитела, образуемые линией

клеток, — клонами, полученной методом гибридом из одной клетки. Метод гибридом

позволяет получать моноклональные антитела с одинаковой специфичностью и в

неограниченных количествах.

Методы иммунофлюоресцентного анализа широко и эффективно используются в

современной гистологии. Эти методы применяются для изучения процессов

дифференцировки клеток, выявления в них специфических химических соединений и

структур. Они основаны на реакциях антиген — антитело. Каждая клетка

организма имеет специфический антигенный состав, который главным образом

определяется белками. Продукты реакции можно окрашивать и выявлять в

люминесцентном микроскопе, например выявление актина и тубулина в клетке с

помощью метода иммунофлюоресцентного анализа.

Современные методы исследований позволяют проводить анализ химического

состава различных структурных компонентов клеток, как фиксированных, так и

живых. Изучение отдельных внутриклеточных структур стало возможным после

разработки технологий фракционирования клеточного содержимого.

Страницы: 1, 2