Реферат: Клонирование (Долли - случайность или закономерность?)
Клонирование (ДОЛЛИ - СЛУЧАЙНОСТЬ ИЛИ ЗАКОНОМЕРНОСТЬ?)
Термин "клон" происходит от греческого слова "klon", что означает - веточка,
побег, черенок, и имеет отношение прежде всего к вегетативному размножению.
Клонирование растений черенками, почками или клубнями в сельском хозяйстве, в
частности в садоводстве, известно уже более 4-х тыс. лет. Начиная с 70-х
годов нашего столетия для клонирования растений стали широко использовать
небольшие группы и даже отдельные соматические (неполовые) клетки.
Дело в том, что у растений (в отличие от животных) по мере их роста в ходе
клеточной специализации - дифференцировки - клетки не теряют так называемых
тотипотентных свойств, т.е. не теряют своей способности реализовывать всю
генетическую информацию, заложенную в ядре. Поэтому практически любая
растительная клетка, сохранившая в процессе дифференцировки свое ядро, может
дать начало новому организму. Эта особенность растительных клеток лежит в
основе многих методов генетики и селекции.
При вегетативном размножении и при клонировании гены не распределяются по
потомкам, как в случае полового размножения, а сохраняются в полном составе в
течение многих поколений. Все организмы, входящие в состав определенного
клона, имеют одинаковый набор генов и фенотипически не различаются между
собой.
Клетки животных, дифференцируясь, лишаются тотипотентности, и в этом - одно
из существенных их отличий от клеток растений. Как будет показано ниже,
именно здесь - главное препятствие для клонирования взрослых позвоночных
животных.
Первые опыты на амфибиях
Возможность клонирования эмбрионов позвоночных впервые была показана в начале
50-х годов в опытах на амфибиях. Американские исследователи Бриггс и Кинг
разработали микрохирургический метод пересадки ядер эмбриональных клеток с
помощью тонкой стеклянной пипетки в лишенные ядра (энуклеированные)
яйцеклетки [1]. Они установили, что если брать ядра из клеток зародыша на
ранней стадии его развития - бластуле, то примерно в 80% случаев зародыш
благополучно развивается дальше и превращается в нормального головастика.
Если же развитие зародыша, донора ядра, продвинулось на следующую стадию -
гаструлу, то лишь менее чем в 20% случаев оперированные яйцеклетки
развивались нормально. Эти результаты позже были подтверждены и в других
работах.
Большой вклад в эту область внес английский биолог Гердон. Он первым в опытах с
южноафриканскими жабами Xenopus laevis (1962) в качестве донора ядер
использовал не зародышевые клетки, а уже вполне специализировавшиеся клетки
эпителия кишечника плавающего головастика [2]. Ядра яйцеклеток реципиентов он
не удалял хирургическим путем, а разрушал ультрафиолетовыми лучами. В
большинстве случаев реконструированные яйцеклетки не развивались, но примерно
десятая часть их них образовывала эмбрионы. 6,5% из этих эмбрионов достигали
стадии бластулы, 2,5% - стадии головастика и только 1% развился в половозрелых
особей (рис. 1). Однако появление нескольких взрослых особей в таких условиях
могло быть связано с тем, что среди клеток эпителия кишечника развивающегося
головастика довольно длительное время присутствуют первичные половые клетки,
ядра которых могли быть использованы для пересадки. В последующих работах как
сам автор, так и многие другие исследователи не смогли подтвердить данные этих
первых опытов.
Позже Гердон модифицировал эксперимент [3]. Поскольку большинство
реконструированных яйцеклеток (с ядром клетки кишечного эпителия) погибают до
завершения стадии гаструлы, он попробовал извлечь из них ядра на стадии
бластулы и снова пересадить их в новые энуклеированные яйцеклетки (такая
процедура называется "серийной пересадкой" в отличие от "первичной
пересадки"). Число зародышей с нормальным развитием после этого
увеличивалось, и они развивались до более поздних стадий по сравнению с
зародышами, полученными в результате первичной пересадки ядер.
Затем Гердон вместе с Ласки (1970) стали культивировать in vitro (вне организма
в питательной среде) клетки почки, легкого и кожи взрослых животных и
использовать уже эти клетки в качестве доноров ядер [4]. Примерно 25% первично
реконструированных яйцеклеток развивались до стадии бластулы. При серийных
пересадках они развивались до стадии плавающего головастика. Таким образом было
показано, что клетки трех разных тканей взрослого позвоночного (X. laevis
) содержат ядра, которые могут обеспечить развитие по крайней мере до стадии
головастика.
В сною очередь ДиБерардино и Хофнер использовали для трансплантации ядра
недслящихся и полносгью дифференцированных клеток крови - эритроцитов лягушки
Rana pipiens [5]. После серийной пересадки таких ядер 10% реконструированных
яйцеклеток достигали стадии плавающего головастика. Однако даже с помощью
многократных серийных пересадок (более 100 клеточных циклов) реконструированные
яйцеклетки дальше стадии головастика не развивались.
Таким образом, во многих работах показано, что в случае амфибий донорами ядер
могут быть лишь зародыши на ранних стадиях развития. Некоторые авторы
называют подобные эксперименты клонированием амфибий, хотя правильнее
называть их клонированием эмбрионов амфибий, так как в этом случае мы
размножаем бесполым путем не взрослых животных, а зародышей.
Дифференцировка клеток в ходе развития позвоночных сопровождается инактивацией
неработающих генов. Поэтому клетки теряют тотипотентность, дифференцировка
становится необратимой. В конце концов у одних клеток происходит полное
репрессирование генома, у других - в той или иной степени деградирует ДНК, а в
некоторых случаях разрушается даже ядро. Однако наряду с дифференцированными
кочетками культивируемые in vitro клеточные популяции содержат
малодифференцированные стволовые клетки, которые и могут быть использованы как
доноры ядер для клонирования млекопитающих.
Опыты с амфибиями показали, что ядра различных типов клеток одного и того же
организма генетически идентичны и в процессе клеточной дифференцировки
постепенно теряют способность обеспечивать развитие реконструированных
яйцеклеток, однако серийные пересадки ядер и культивирование клеток in
vitro в какой-то степени увеличивает эту способность.
Неудачи экспериментов с мышами
Успешные опыты с амфибиями заставили ученых задуматься о клонировании эмбрионов
млекопитающих, в частности мышей. МакКиннел в одной из своих работ отмечал, что
все необходимые для этого методы уже существуют, и непонятно, почему мышь до
сих пор не клонирована. По его мнению, первыми объектами должны были стать
именно мелкие животные, такие как мышь или кролик. Однако предсказание
МакКиннелла не сбылось, хотя в конце 70-х годов опыты на мышах действительно
начались и протекали весьма драматично. К тому времени, замечу, весьма
основательно были изучены биология и генетика ранних этапов развития
млекопитающих, и, в частности, мыши как модельного объекта.
Работа методически оказалась довольно трудной, прежде всего потому, что объем
яйцеклетки у млекопитающих примерно в тысячу раз меньше, чем у амфибий.
Однако эти трудности были успешно преодолены. Экспериментаторы научились
микрохирургически удалять пронуклеусы [6] из зигот (оплодотворенных
яйцеклеток) мыши и пересаживать в них клеточные ядра ранних эмбрионов. Однако
все полученные разными способами зародыши мышей развивались лишь до стадии
бластоцисты [7].
6. Пронуклеус - одно из двух гаплоидных ядер в яйце млекопитающих в период
после проникновения сперматозоида, но до слияния мужского и женского
пронуклеусов в ядро зиготы в процессе оплодотворения. Мужское ядро
формируется из ядерного материала сперматозоида, женское - из хромосом
яйцеклетки.
7. Бластоциста (бластула) - зародыш млекопитающих на одной из ранних стадий
развития, еще до его имплантации в матку.
В 1977 году появилось сенсационное сообщение Хоппе и Илменси о том, что они
получили семь взрослых самок мышей, пять из которых имели голько магеринский, а
две - отцовский геном [8]. Это, якобы, зависело от гого, какой пронуклеус был
оставлен в яйце - женский или мужской, он и определял развитие особи но типу
гиногенеза или андрогенеза. Их успех был связан, но описанию авторов, с гем,
что, удаляя один нронуклеус, они удваивали число хромосом другого, обрабатывая
яйца специальным веществом, затем выращивали полученные диплоидные гомочиготные
(с двумя одинаковыми наборами генов) зародыши in vitro до стадии
бластоцисты и пересаживали в матку самки-реципиента для дальнейшего развития.
Казалось, теперь можно будет быстро получать млекопитающих со 100%-ной
гомозиготностью по всем генам. Это особенно важно в селекции, так как для
получения сельскохозяйственных животных, в частности, крупного рогатого
скота, с закрепленными особо ценными качествами обычными приемами требуются
десятки лет работы.
Однако, к сожалению, данные Хоппе и Илменси подтвердить не удалось, хотя
многие пытались это сделать. Оказалось, что полученные любым способом
диплоидные андрогенетические и гиногенетические зародыши мышей погибают на
тех же стадиях, что и диплоидные партеногенетические (развивающиеся из
неоплодотворенной яйцеклетки) эмбрионы.
Значительно усовершенствовав методы извлечения ядер и введения их в клетку,
МакГрат и Солтер провели свою серию экспериментов и сообщили, что высокий
выход живых мышей они получили, когда в качестве доноров ядер использовали
зиготы, но если донорами были ранние эмбрионы, то реконструированные
яйцеклетки, как и прежде, развивались только до стадии бластоцисты [9].
Метод МакГрата и Солтера стал широко использоваться разными
экспериментаторами. Так, Манн и Ловел-Бадж выделяли пронуклеусы из яиц,
активированных к партеногенезу, и пересаживали их энуклеированные зиготы
мышей [10]. В этих случаях эмбрионы погибали на ранних стадиях. Если же
наоборот, пронуклеусы получали из оплодотворенных яиц и пересаживали в
партеногенетически активированные и лишенные ядра яйца, то такие зародыши
развивались нормально до рождения. Сурани с соавторами установили, что если
добавить женский пронуклеус из зиготы мыши к гаплоидному набору хромосом
яйцеклетки, то нормального развития не происходит, добавление же мужского
ядра приводит к нормальному развитию [11]. С другой стороны, рекомбинации
мужского и женского пронуклеусов из разных оплодотворенных яйцеклеток мышей
обеспечивает нормальное развитие, а комбинация двух мужских или двух женских
пронуклеусов останавливает развитие эмбриона [12].
Эти опыты показали, что для нормального развития млекопитающих требуются два
набора хромосом - отцовский и материнский. Поэтому ни у одного из известных
видов млекопитающих не описан партеногенез. Поэтому работы Хоппе и Илменси не
удалось повторить.
Однако эти исследователи еще дважды будоражили научное сообщество. В 1982
году они пересадили ядра клеток партеногенетических бластоцист мышей в
энуклеированные зиготы Некоторые из этих реконструированных яйцеклеток
нормально развивались, и якобы были получены четыре взрослых самки. В свете
вышесказанного эти результаты весьма маловероятны.
Гибель партеногенетических (гиногенетических) и андрогенетических зародышей у
млекопитающих связана с различной активностью в онтогенезе материнского и
отцовского геномов. Механизм, регулирующий эти функциональные различия, был
назван геномным импринтингом [13] и изучался в ряде работ, где было показано,
что для нормального развития млекопитающих требуется наличие мужского генома.
Другая статья Илменси и Хоппе [14] имела еще больший резонанс.
Авторы сообщили о пересадке ядер клеток внутренней клеточной массы бластоцисты в
энуклеированные зиготы мышей и получении трех взрослых мышей (двух самок и
самца), генетически идентичных донорской линии мышей. Введение ядер-доноров и
удаление пронуклеусов из зиготы проводили за один прием, затем
реконструированные яйцеклетки культивировали in vitro до стадии
бластоцисты и пересаживали в матку самок. Из 16-ти пересаженных бластоцист три
развились во взрослых животных. В следующей работе (1982) эти же авторы
использовали в качестве доноров ядер клетки эмбрионов еще более поздних стадий
(7 суток) и будто бы получили трех половозрелых мышей. Однако никто из
работающих в том же направлении не смог добиться подобных результатов, и
достоверность данных Илменси и Хоппе была вновь поставлена под сомнение.
Страницы: 1, 2, 3
|