Каталог Рефератов - Легко- и трудногидролизуемые полисахариды

	Информационно-образоательный портал
	Рефераты, курсовые, дипломы, научные работы,



МЕНЮ\|

поиск

Легко- и трудногидролизуемые полисахариды

ндикатором при титровании служит метиленовый голубой, который в окислительной среде имеет синий цвет, а в восстановительной бесцветен. Для предотвращения выпадения осадка оксида меди в медно-щелочной раствор добавляют желтую кровяную соль калия, которая образует с Cu2O растворимое комплексное соединение.

Для проведения анализа приготовляют два раствора: А - 10 г CuSO4 ·5З20 и 0,04 г метиленового голубого растворяют в воде в мерной колбе на 1 дм3 доведением до метки; Б - 50 г сегнетовой соли растворяют в воде, отдельно растворяют в воде 4 г желтой кровяной соли, переносят оба раствора в мерную колбу на 1 дм \ добавляют 75 г NaOH в виде 50% -ного водного раствора и доводят водой до метки.

Прибор для определения PB эбулиостатическим методом и дозаторы растворов. Дозатор для отмеривания раствора А представляет собой два сообщающихся сосуда. Сосуд вместимостью около 100 см3 служит для хранения раствора А и сосуд-пипетка для его отмеривания. На верхнем и нижнем отводах сосуда-пипетки нанесены метки, соответствующие объему 5 cmj. Для отмеривания раствора А открывают кран / и заполняют сосуд-пипетку до верхней метки. Затем кран закрывают. При отмеривании раствора А и заливании его в эбулиостат открывают кран 2 и спускают раствор до нижней метки. Второй дозатор для отмеривания раствора Б представляет собой пипетку вместимостью 5 см, к верхнему концу которой припаян трехходовой кран. На верхний отвод тройника надета резиновая груша. Раствор Б хранят в колбе вместимостью 100 см', откуда набирают в пипетку, а из пипетки спускают в эбулиостат.

В зависимости от массовой доли PB в растворе и интенсивности его окраски применяют два варианта титрования: для светлых растворов, содержащих 0,13...0,05% PB1 используют прямое титрование раствором сахара; для темных растворов или растворов, содержащих меньше 0,05% PB1 применяют дотитровывание раствором глюкозы.

Методика анализа по первому варианту. В колбу прибора наливают воду и ставят прибор на электрическую плитку. Для равномерного образования пара на дно колбы помещают кусочки пористого стекла или шамота. Когда вода закипит, вынимают из колбы эбулиостат и наливают в него из дозаторов сначала 5 см3 раствора А, а затем 5 см3 раствора Б. Осторожно перемешивают растворы в эбулиостате и медленно вставляют эбулиостат вместе с пробкой в колбу.

Затем верхнее отверстие эбулиостата закрывают пробкой с бюреткой, в которую наливают исследуемый раствор сахара. Регулируют выход пара через отводную трубку таким образом, чтобы жидкость в эбулиостате нагрелась до температуры кипения воды примерно за 0,5 мин. Как только пар начнет проходить через медно-щелочной раствор, начинают титрование раствором сахара.

Сначала проводят ориентировочное определение. Раствор сахара из бюретки добавляют по каплям со скоростью одна капля за 1...2 с до перехода окраски раствора из синей в желтую и замечают объем раствора сахара, израсходованного на титрование. Затем проводят окончательное определение. В эбулиостат заливают новую порцию медно-щелочного раствора, подготавливают эбулиостат к титрованию, как указано выше, и начинают титрование. Вначале сразу прибавляют 80...90% объема раствора сахара, израсходованного при ориентировочном определении, и через 2 мин с начала пробулькивания пара через жидкость в эбулиостате дотитровывают, прибавляя раствор сахара со скоростью одна капля за 6...7 с, до перехода синей окраски в желтую от одной капли сахарного раствора.

По бюретке определяют объем раствора сахара, израсходованного на титрование 10 CMi медно-щелочного раствора.

Массовую долю PB1%, в гидролизате легкогидролизуемых полисахаридов или в разбавленном нейтрализованном гидролизате трудногидролизуемых полисахаридов г, и ст соответственно рассчитывают по формуле

где T1 - титр медно-щелочного раствора по глюкозе для первого варианта, мг; х - объем гидролизата, израсходованный на титрование 10 см1 медно-щелочного раствора.

Методика анализа по второму варианту. Подготавливают прибор к работе, как и в первом варианте, но в эбулиостат кроме 5 см1 раствора А и 5 см3 раствора Б, добавляют, отмеривая пипеткой, определенный объем раствора сахара. В случае темного раствора, содержащего более 0,05% PB, этот объем должен составлять 1...2 см3, а в случае раствора с массовой долей PB менее 0,05% - 5 см3. Затем к жидкости в эбулиостате добавляют из бюретки такой объем раствора глюкозы концентрацией около 0,1 г/100 см3, чтобы на дотитровывание после 2 мин кипячения потребовалось бы не более 1 см3 этого раствора. Добавляемый объем определяют предварительным анализом. Концентрация добавляемого раствора глюкозы должна быть установлена точно; удобнее всего пользоваться раствором глюкозы, приготовленным для установки титра медно-щелочного раствора,

После перемешивания жидкости эбулиостат с пробкой медленно вставляют в колбу, закрывают его пробкой с бюреткой, в которую налит раствор глюкозы. Через 2 мин с начала пробулькивания пара через жидкость в эбулиостате проводят дотитровывание раствором глюкозы, добавляя его со скоростью одна капля за 6...7 с до перехода окраски в желтую от одной капли раствора глюкозы, израсходованного на дотитровывание.

Массовую долю PB,%, в гидролизате легкогидролизуемых полисахаридов или в разбавленном нейтрализованном гидролизате трудногидролизуемых полисахаридов сл и сг соответственно рассчитывает по формуле

где T2 - титр медно-щелочного раствора по глюкозе для второго варианта, мг; с.

При фотоколориметрическом методе для обнаружения бесцветных Сахаров на бумаге хроматограмму проявляют - обрабатывают раствором проявителя, дающего с сахарами окрашенные соединения. Количества разделенных моносахаридов приближенно можно определить непосредственно на хроматограмме прямым измерением интенсивности окраски пятен. Однако из-за нестабильности окраски и существенного влияния условий обработки хроматограмм точность этого метода невелика: относительная ошибка измерений достигает 10...15%. Более точным способом является извлечение окрашенных продуктов из хроматограммы - э л ю и с о в а н и е с последующим фотометрированием полученных растворов - злюатов на фотозлектроколориметре или спектрофотометре.

Для разделения Сахаров применяют специальную хроматографическую бумагу № 1 или Ne 2, которую нарезают полосками. Скорость разделения больше на полоске бумаги с продольным расположением волокон, чем на полоске с поперечным расположением. Иногда для лучшего разделения Сахаров необходимо обеспечить более медленное движение растворителя. С этой целью бумагу нарезают в направлении, перпендикулярном направлению волокон.

Хроматографирование осуществляют нисходящим или восходящим потоками жидкости. В первом случае бумагу подвешивают, укрепляя верхний конец в сосуде с растворителем. Во втором случае бумагу помещают в растворитель нижним концом. Когда сахара трудно разделяются, рекомендуется повторное хроматографирование.

Растворитель должен обеспечивать максимальное различие в значениях Rt и сам должен быть высокоподвижен. При разделении Сахаров используют, например, следующие системы растворителей: этилацетат - пиридин - вода.,; н-бутанол - уксусная кислота - вода; н-бутанол - ацетон - вода, и др. Разделение Сахаров зависит от состава растворителя.

Для повышения эффективности разделения растворителю дают возможность стекать до тех пор, пока сахара не разделятся по всей длине хроматограммы. При этом вычислить значения R1 невозможно, так как неизвестен путь, пройденный фронтом растворителя. В этом случае подвижность определяют косвенным способом, сравнивая пути, пройденные разделяемыми веществами, с перемещением пятна вещества с известным Rj. В химии углеводов часто используют ксилозу и определяют коэффициент подвижности Rkc как отношение расстояния, пройденного сахаром, к расстоянию, пройденному в этих же условиях ксилозой. Кроме природы сахара и состава растворителя на коэффициент подвижности влияют качество бумаги и температура среды.

В качестве проявителей применяют разнообразные реагенты в зависимости, от состава разделяемых смесей. Для проявления хроматограмм гидролизатов растительных тканей, содержащих редуцирующие сахара, одним из лучших проявителей считают раствор анилинфталата в этаноле. При проявлении анилинфталатом пентозы в зависимости от количества дают окраску от розовой до темно-красной, гексозы - зеленовато-коричневую, рамноза - светло-коричневую. Для элюирования окрашенных соединений из хроматограммы используют ледяную уксусную кислоту или раствор соляной кислоты в этаноле.

Методика анализа. Разделение Сахаров проводят нисходящим способом при непрерывном протекании растворителя по бумаге.

Подготовка гидролизата. Концентрация PB в гидролизате, подготовленном для хроматографирования, должна находиться в пределах 1...3%. При необходимости гидролизат упаривают. Упаривание проводят в вакуум-сушильном шкафу при температуре 50...60°С или при нагревании на водяной бане в фарфоровой чашке или в стеклянном стакане. Гидролизат легкогидролизуемых полисахаридов предварительно нейтрализуют концентрированным раствором гидроксида натрия до слабощелочной реакции и подкисляют концентрированной уксусной кислотой до рН 5, затем упаривают и фильтруют через простую конусообразную воронку с бумажным фильтром. Гидролизат трудногидролизуемых полисахаридов нейтрализуют карбонатом бария и отфильтровывают осадок сульфата бария. Полученный фильтрат сразу подвергают хроматографированию. При необходимости производят упаривание после подкисления уксусной кислотой до рН 5 и снова фильтруют. Кратность упаривания точно определяют и учитывают при расчете масс моносахаридов.

Приготовление растворителя. Для приготовления смеси этилацетат - пиридин - вода 150 см3 этилацетата и 30 см3 пиридина хорошо взбалтывают в делительной воронке вместимостью 500 см3, затем прибавляют к смеси 150 см3 дистиллированной воды и снова хорошо взбалтывают в течение 2...3 мин. После этого смесь оставляют для расслаивания. Когда верхний слой жидкости станет прозрачным, нижний слой сливают, а верхний используют для хроматографирования. Подобным образом готовят и другие составы растворителей, смешивая органические растворители и воду в соответствующих пропорциях.

Хроматографическое разделение. Установка для хроматографирования представляет собой широкий цилиндр с притертой крышкой. Внутрь цилиндра помещают малый цилиндр, на который ставят чашку с растворителем.

Нарезают 10...12 полосок хроматографической бумаги размером 3ч45 см. При хроматографировании нижний конец полоски может свободно свисать либо его вырезают в виде "язычка", который вставляют в горлышко колбочки-приемника. На расстоянии 10...15 см от другого конца полоски отмечают точку старта, на которую наносят определенное количество подготовленного гидролизата. Все отметки, на бумажной полоске делают только графитовым карандашом.

Пробу гидролизата наносят микропипеткой со специальным приспособлением, состоящим из резиновой груши в металлическом кожухе и микровинта с шариком. Если упаривание гидролизата нежелательно, то на бумагу наносят несколько раз в одно и то же место необходимый объем раствора сахара, который рассчитывают исходя из массовой доли PB. После нанесения каждой порции раствора пятно хорошо просушивают. Диаметр нанесенного пятна не должен превышать 5...6 мм.

Полоски устанавливают в строго вертикальном положении. Конец полоски, на который нанесена проба, загибают в чашку. Пятно пробы должно находиться снаружи чашки ниже ее края не менее чем на 2 см. Второй конец вставляют в колбочку-приемник. Для лучшей идентификации Сахаров в установку помещают также полоску бумаги с нанесенным раствором смеси чистых моносахаридов: галактозы, глюкозы, маннозы, арабинозы, ксилозы. В чашку наливают растворитель и установку герметично закрывают крышкой.

Хроматографирование проводят при температуре 18...22°С, помещая установку в специальную комнату или шкаф. Разделение осуществляется за 24...90 ч. Хроматографирование считают законченным тогда, когда на проявленной хроматограмме расстояния между пятнами будут не менее 3 мм.

После окончания разделения Сахаров хроматограммы сушат на воздухе в течение примерно 4 ч до полного удаления растворителя. При сушке хроматограммы перекидывают через стеклянную палочку, укрепленную на двух штативах.

Проявление хроматограмм. Проявителем служит раствор, содержащий 1,66 г фталевой кислоты и 0,92 см3 свежеперегнанного анилина в 100 см3 этанола.

Сухие хроматограммы смачивают равномерно проявителем кратковременным погружением в раствор, отжимают между листами фильтровальной бумаги и немного подсушивают на воздухе. Затем хроматограммы помещают в сушильный шкаф, предварительно нагретый до нужной температуры. m Несколько хроматограмм одновременно кладут на ребро так, чтобы они не касались друг друга и стенок шкафа. Проявление ведут при температуре 100...105°С в течение 5 мин. Аналогичным образом проявляют полоски бумаги с нанесенным раствором смеси чистых Сахаров. При установлении природы Сахаров руководствуются цветом пятен, их относительным расположением и расположением пятен чистых Сахаров.

Фотоколориметрическое определение Сахаров. Из проявленной хроматограммы вырезают участки, соответствующие отдельным сахарам, и разрезают их на узкие полоски. Помещают кусочки хроматограмм в пробирки с пришлифованными пробками и заливают 8 см3 раствора HCI в этаноле. Элюирование ведут в течение 1 ч при комнатной температуре, поместив пробирки в темноту. Через каждые 5...10 мин пробирки энергично встряхивают.

Элюаты сливают в подготовленные сухие пробирки и фото-метрируют - измеряют оптическую плотность на фотоэлектрическом колориметре при синем светофильтре в кювете толщиной 10 мм или же на спектрофотометре при длине волны 420 нм.

Массу каждого моносахарида определяют по соответствующим градуировочным графикам.

Зная массу сахара в пробе гидролизата, нанесенной на хроматограмме, объем этой пробы, кратность упаривания и общий объем гидролизата, рассчитывают массовую долю, % к абсолютно сухой древесине, соответствующих полисахаридов Р - глюканов, маннанов, галактанов, ксиланов, арабинанов

где Ь - масса моносахарида в пробе гидролизата, мкг; х - объем пробы гидролизата, взятый на хроматографирование, см3; V - общий объем гидролизата, V=500 - или 200 см3; k - коэффициент пересчета моносахаридов на полисахариды, Ј = 0,90 для гексозанов и 0,88 для пентозанов; з - кратность упаривания; g - масса абсолютно сухой навески древесины, г.

Построение градуировочных графиков. Градуировочный график для каждого моносахарида представляет собой зависимость оптической плотности элюата от массы сахара на хроматограмме. Для построения графиков готовят точно 1% -ные растворы чистых моносахаридов. На полоску хроматографической бумаги на расстоянии 3...4 см друг от друга наносят разные количества 1% -ного раствора сахара: 0,01; 0,02; 0,03; 0,04 и 0,05 см3. После высыхания пятен полоску проявляют раствором анилинфталата в этаноле в точно таких же условиях, как и при анализе гидролизатов. Проводят элюирование и фотометрирование, как описано выше. На основании средних данных нескольких параллельных определений для каждого моносахарида строят градуировочный график. Иногда градуировочный график для глюкозы используют для всех гексоз, а график для ксилозы - для всех пентоз. Последний способ менее точен.

6. Анализ гидролизатов методом газожидкостной хроматографии
В гидролизатах происходит мутаротация моносахаридов, т.е. образование равновесной смеси таутомерных форм: б-, в-пиранозных, б-, в-фуранозных и открытой. Для глюкозы это иллюстрирует следующая схема:

Существование таутомерных форм затрудняет определение состава моносахаридов в гидролизате.

Моносахариды нелетучи и непосредственное разделение их смесей методом газожидкостной хроматографии невозможно. Сахара могут быть хроматографически разделены в виде летучих производных - простых и сложных эфиров. Широко распространен метод анализа в виде триметилсилильных производных моносахаридов. Последние являются летучими гликозидами простых О-триметилсилиловых эфиров углеводов, образующихся в результате полного замещения гидроксильных групп моносахаридов при их силировании.

В качестве силирующего реагента моносахаридов используют смесь триметилхлорсилана и гексаметилдисилазана в среде пиридина.

В качестве примера приводится схема реакции силирования для галактозы

Подобным образом синтезируются TMС-производные других моносахаридов. При этом устанавливается новая равновесная смесь, в которой преобладают пиранозные формы. Соотношение таутомеров в зависимости от условий колеблется. Состав ТМС-производных таутомерных форм индивидуальных моносахаридов приведен ниже.

Для уменьшения числа пиков на хроматограмме и упрощения ее обработки моносахариды восстанавливают до соответствующих многоатомных спиртов с последующим их превращением в ацетаты. Каждый полиол дает на хроматограмме один пик, поскольку таутомерия у полиолов невозможна.

При анализе ТМС-производных методом газожидкостной хроматографии инертный газ служит подвижной фазой, неподвижной фазой является жидкость, нанесенная тонким слоем на твердый носитель. В качестве жидкой фазы используют различные силиконовые масла и полиэфиры. Наиболее селективными фазами из вырабатываемых отечественной промышленностью являются неполярное метилхлорсиликоновое масло и полярный политриэтиленгликольсебацинат. В качестве твердого носителя применяют адсорбенты порохром-3 или хромат N.

Для хроматографического разделения смеси летучих производных моносахаридов используют газовые хроматографы, состоящие из колонки с термостатом, в которой происходит разделение смеси, пламенно-ионизационного детектора, дающего сигнал прямо пропорциональный количеству анализируемого вещества, блоков управления и самопишущего прибора. Выход ТМС-производных, регистрирующийся самопишущим прибором в виде пика на диаграммной ленте, соответствует времени удерживания tR - времени, прошедшего с момента введения пробы в колонку до момента появления компонента смеси в детекторе.

В соответствии с tR на хроматограмме в определенном порядке появляются пики индивидуальных соединений. Xpoматограмма - совокупность пиков, соответствующая порядку выхода и массе индивидуальных компонентов смеси. Порядок выхода при хроматографическом разделении ТМС-производных зависит от жидкой фазы. Его устанавливают предварительно для данной фазы с использованием модельных ТМС-производных чистых моносахаридов по их времени удерживания. На рис. приведена в качестве примера хроматограмма модельной смеси, разделенной на колонке с метилхлорфенил-силиконовым маслом в качестве жидкой фазы.

Существует несколько методов количественного определения состава смеси по полученным хроматограммам. По первому методу определяют площади пиков всех таутомеров каждого моносахарида расчетом площади треугольной аппроксимацией пика - умножением основания пика на половину высоты. При частичном наложении пиков друг на друга и невозможности прямого измерения основания площадь пика определяют умножением его высоты на ширину, измеренную на половине высоты. Возможно также определять долю каждого пика его переносом на бумагу и взвешиванием вырезанного из нее пика на аналитических весах, относя найденную массу к массе всех анализируемых пиков. Результат выражают в процентах, используя метод нормировки площадей.

Хроматограмма модельной смеси TMC производных моносахаридов

По второму методу количественное определение массовой доли конкретного моносахарида в смеси производят по площади пика одного из его таутомеров, исходя из условия, что при синтезе ТМС-производных в строго постоянных условиях соотношение таутомеров сохраняется постоянным. Это позволяет для расчета выбрать наиболее разрешенный пик, называемый характеристическим. В качестве таких пиков обычно используют пики ТМС-производных в-Ж,-арабинопиранозы, в-П-кси-лопиранозы, a-D-маннопиранозы, a-D-галактопиранозы и в-D-глюкопиранозы. Площади пиков остальных таутомеров непосредственно не измеряют, а находят расчетом. С учетом доли характеристического пика вычисляют общую площадь пиков всех таутомеров данного моносахарида. Количественное соотношение таутомерных форм необходимо устанавливать для данных условий хроматографирования и при. их изменении определение следует проводить вновь. Долю конкретного моносахарида находят отнесением площади всех пиков данного моносахарида к общей площади всех пиков.

Количественное определение массы индивидуальных моносахаридов производят с использованием внутреннего стандарта. Масса сорбита, добавляемая в анализируемую смесь, должна обеспечить его концентрацию в растворе, примерно соответствующую концентрации индивидуальных моносахаридов. Расчет ведут по градуировочному графику. График получают, по данным хроматографирования эталонных растворов, содержащих индивидуальный моносахарид и сорбит. Градуировочный график строят в координатах: по оси абсцисс - масса чистого моносахарида в эталонном растворе, по оси ординат - отношение площади характеристического пика этого же моносахарида к площади пика внутреннего стандарта. График имеет линейную форму. Прямую линию проводят с использованием метода наименьших квадратов.

Относительная ошибка определений Сахаров в гидролизате зависит от их массовой доли в жализируемой смеси и составляет 1...5%. Общее время анализа при серийном проведении определений около 2 ч, не считая времени на получение градуировочных графиков.

Методика анализа. Анализ гидролизатов методом газожидкостной хроматографии включает подготовку гидролизатов к анализу, синтез ТМС-производных моносахаридов, хроматографическое разделение этих производных и обработку хроматограмм.

Подготовка гидролизатов к анализу. Гидролизаты, полученные при обработке древесины концентрированной серной кислотой, нейтрализуют карбонатом бария до рН 5. Раствор отфильтровывают через конусообразную стеклянную воронку с бумажным фильтром от осадка сульфата бария. Гидролизаты, полученные при обработке древесины соляной кислотой, нейтрализуют карбонатом натрия до рН 5. В полученных гидролизатах определяют массовую долю PB. При необходимости гидролизат упаривают в вакуум-сушильном шкафу при температуре 40°С.

Синтез ТМС-производных моносахаридов. В круглодонную колбу вместимостью 50 см3 вносят пипеткой пробу нейтрализованного и упаренного гидролизата, содержащего около 20 мг PB.

Работу выполняют в двух вариантах - с внутренним стандартом или без него.

Раствор сорбита вносят в колбу пипеткой в объеме, соответствующем его массе, равной 2...5 мг. Колбу присоединяют к ротационному вакуумному испарителю и выпаривают раствор при температуре 40...42°С и остаточном давлении 0,5...1 кПа. Выпаривание производят досуха. Для удаления следов воды к упаренной пробе добавляют 2...3 раза по 1 см3 спиртотолуольной смеси, которую также удаляют упариванием. Затем сухой остаток в этой же колбе растворяют в 2 см3 свежеперегнанного сухого пиридина, добавляют 0,6 см3 гексаметилдисилазана и 0,3 см3 триметилхлорсилана. Колбу закрывают пробкой, энергично встряхивают 30 с и при комнатной температуре выдерживают реакционную смесь в течение 10 мин.

Если анализируемая проба плохо растворяется, колбу нагревают на водяной бане при температуре 75...85°С в течение 2...3 мин. Затем проводят упаривание пиридина из реакционной смеси на ротационном испарителе при температуре 40°С и остаточном давлении 0,5...1 кПа в течение 10 мин. Остаток растворяют в этой же колбе в 2 см3 "-гексана. В хорошо закрытых колбах ТМС-производные устойчивы в течение нескольких недель.

Массовую долю каждого моносахарида в гидролизате, %, рассчитывают по формуле

где т, - масса моносахарида в пробе гидролизата, мг; х - объем пробы гидролизата, см3.

По полученным значениям с, Для гидролизатов легко - и трудногидролизуемых полисахаридов рассчитывают массовые доли соответствующих полисахаридов в процентах по отношению к абсолютно сухой древесине.

По второму варианту рассчитывают долю каждого моносахарида в процентах от их обшей массы по методу нормировки площадей. Вычисляют сумму площадей всех пиков S и площади пиков каждого моносахарида S4.

Массовую долю каждого моносахарида, % к их общей массе, рассчитывают по формуле

Определение времени удерживания моносахаридов и построение градуировочных графиков. По первому варианту анализа готовят эталонные растворы определенной концентрации чистых моносахаридов и внутреннего стандарта - сорбита. Для каждого моносахарида готовят пять эталонных растворов концентрацией от 2 до 10 мг/см3. Концентрация раствора сорбита постоянна - 4 мг/см3. Из каждого раствора отбирают три пробы, синтезируют TMC-производные и хроматографируют, как указано выше. На каждой из трех хроматограмм для каждого пика фиксируют значение tR, вычисляют площадь характеристического пика таутомера моносахарида S1 и площадь пика сорбита Scl. Таким образом находят S,/Scr для всех пяти эталонных растворов. По средним значениям результатов трех параллельных анализов для каждого из пяти эталонных растворов строят графики зависимости отношений SJScr от массы моносахаридов, пользуясь методом наименьших квадратов.

Время удерживания для каждого моносахарида находят по шкале времени хроматограмм.

Страницы: 1, 2

© 2003-2013
Рефераты бесплатно, курсовые, рефераты биология, большая бибилиотека рефератов, дипломы, научные работы, рефераты право, рефераты, рефераты скачать, рефераты литература, курсовые работы, реферат, доклады, рефераты медицина, рефераты на тему, сочинения, реферат бесплатно, рефераты авиация, рефераты психология, рефераты математика, рефераты кулинария, рефераты логистика, рефераты анатомия, рефераты маркетинг, рефераты релиния, рефераты социология, рефераты менеджемент.