Подлинность ЛВ методом ГЖХ можно подтвердить либо с помошью свидетелей, либо методом относительных удерживаний, В первом случае доказательством идентичности служит совпадение времени удерживания вешества-свидетеля и одного из компонентов смеси ЛВ при хроматографировании каждого в отдельности в одинаковых условиях. Во втором случае вещество-свидетель добавляют к пробе, затем анализируют по рекомендуемой методике. Рассчитывают по формуле величину относительного удерживания, которая является постоянной для ЛВ в конкретных условиях. Количественный анализ выполняют в тех же условиях, используя для расчетов такие параметры, как площадь или высота пиков ЛВ. Площадь пиков устанавливают на хроматограмме с помощью планиметра, интегратора или умножением высоты пика на его полуширину.

Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) отличается от ГЖХ тем, что подвижной фазой служит не газ, а жидкость, причем она проходит через колонку, наполненную сорбентом, с большой скоростью за счет значительного давления. Поэтому ВЭЖХ позволяет разделять многокомпонентные смеси на индивидуальные вещества высокой степени чистоты. ВЭЖХ отличается высокой чувствительностью {до 10 6 г). На разделение 10-15 компонентов затрачивается 20-30 мин.

Жидкостный хроматограф включает такие узлы, как дозатор, насос высокого давления, высокоэффективная колонка, детектор с регистрирующим устройством. Колонки изготавливают из нержавеющей стали, они имеют длину 10-25 см, внутренний диаметр 0,3-0,8 см и плотно набиваются адсорбентом с размером частиц 5-10 мкм. В качестве элюента используют различные углеводороды в сочетании с этанолом. Детектором обычно служит спектрофотометр с переменной длиной волны (190-900 нм), но существуют также флуориметрические. электрохимические и другие детекторы.

Подлинность испытуемых ЛВ подтверждают по времени выхода каждого компонента смеси из колонки, которое будет стабильно при одинаковых условиях проведения эксперимента. Количественное содержание рассчитывается по площади пика, которая пропорциональна количеству ЛВ в пробе.(2)

4. Методы выделения кумаринов

Для выделения кумаринов из растений обычно применяются различные растворители: этанол, метанол, бензол, хлороформ, диэтиловый и петролейный эфиры или их комбинации.

4.1. Наиболее полная экстракция кумаринов (в свободной форме и в форме гликозидов) достигается при использовании спирта этилового различных концентраций, как на холоду, так и при нагревании. Для очистки суммы кумаринов от сопутствующих веществ густой экстракт, полученный после отгонки экстрагента, обрабатывают хлороформом, диэтиловым или петролейным эфиром. При использовании в качестве экстрагента петролейного эфира хорошо извлекается смесь фурокумаринов, которые после концентрирования экстракта можно выделить в кристаллическом состоянии. В ряде случаев дополнительно проводится обработка экстракта активированным углем, кипящей водой с последующим сгущением и дальнейшим извлечением гидроксилированных и метоксилированных кумаринов хлороформом, этилацетатом и бутанолом, непосредственная обработка сухого остатка смесью хлороформа -- этиловый спирт (97:3) (для выделения аналогичных производных) или же используется само спиртовое извлечение. Например, для извлечения суммы 7-гидроксилированных кумаринов из корней Helianthus annum L. предложено проводить последовательную экстракцию ацетоном, смесью ацетон -- метанол (1:1) с последующим освобождением от пигментов в делительной воронке смесью гексан -- эфир (6:4). Иногда целесообразно растительный материал обрабатывать петролейным эфиром, а затем исчерпывающе экстрагировать хлороформом или метанолом. Для выделения пеуцеданина применяют экстракцию метанолом в аппарате Сокслета, аналогичным способом с использованием последовательной экстракции семян Angelica archangelica L. н-гексаном, дихлорметаном и метанолом и последующей препаративной ТСХ были выделены шесть производных фурокумарина. Эти же экстрагенты позволяют получить сумму кумаринов и фурокумаринов из растения Metrodorea flavida. Для выделения гидрокси-, алкоксикумаринов и их гликозидов из семян Aesculus hippocastanum L. применяется экстракция 80 % этиловым спиртом с последующей обработкой горячей водой, фильтрованием и многократным извлечением веществ хлороформом, этилацетатом и бутанолом. Эскулин и фраксин из коры каштана получали путем экстракции из метанола. В гексановых и метанольных извлечениях из побегов Kielmeyera reticulata Saad., полученных последовательно, обнаружены 4-фенилкумарины и 4-н-пропилкумарины.

4.2. Для очистки кумаринов от сопутствующих веществ возможно использование метода омыления. Для выделения кумаринов проводят:

1. Экстракцию ЛРС органическим растворителем (эфиром) получают сумму кумаринов и балластных веществ.

2. Эфирный слой отделяют, отработанное сырьё выбрасывают.

3. Полученное эфирное извлечение обрабатывают 0,5% водным раствором КОН для очистки от фенолов и кислот.

4. Затем это же извлечение обрабатывают 10% спиртовым раствором КОН. Происходит разрыв лактонного кольца и образуются кумарины, которые переходят в водный слой. А в органическом растворителе остаются балластные вещества (смолы, стерины, спирты), органическую фазу выбрасывают.

5. Водно-щелочной слой подкисляют разбавленной НСl. Происходит замыкание лактонного кольца, образуются кумарины, которые экстрагируют органическим растворителем.

6. Органический слой отгоняют - получают сумму кумаринов, которую разделяют хроматографически.

Существенными недостатками этого метода являются возможность образования вторичных продуктов распада кумаринов, дегидратации и изомеризации некоторых оксикумаринов.

Дальнейшие операции, как правило, направлены на разделение суммы кумаринов и выделение индивидуальных соединений. В ранних исследованиях использовались кристаллизация, фракционная перегонка или сублимация в высоком вакууме. Однако многие кумарины обладают сходной растворимостью в органических растворителях, поэтому даже многократная перекристаллизация не позволяет достичь надежного результата.

Поэтому дальнейшее развитие химии кумаринов привело к использованию для этих целей различных видов хроматографии, лишенных вышеуказанных недостатков.(6,7)

4.3 Хроматографическое определение:

Для обнаружения кумаринов в растениях и сырье используются лактоновые свойства кумаринов, их способность флуоресцировать при ультрафиолетовом освещении и давать окрашенные растворы со специальными реактивами, микросублимацию и хроматографический анализ экстрактов сырья.(1):

На пластинку "Силуфол" или хроматографическую бумагу наносят исследуемые экстракты и помещают в хроматографическую камеру с системой, указанной в НД на исследуемое сырье. Хроматограммы после высушивания просматривают в УФ-свете. Флуоресцирующие пятна кумаринов отмечают простым карандашом и хроматограммы обрабатывают щелочью. После этого их высушивают в сушильном шкафу при t=120°C и вновь просматривают в УФ-свете. Затем хроматограмму обрабатывают диазотированным сульфаниламидом, от действия которого кумарины в зависимости от структуры окрашиваются в оранжевый, красно-оранжевый, фиолетовый цвета.

В некоторых случаях после просматривания хроматограммы в УФ-свете ее обрабатывают реактивом Драгендорфа (Bil3 в KI) или парами иода. Кумарины проявляются в виде пятен, окрашенных в коричневый цвет.

В первую очередь, проводят колоночную хроматографию с использованием различных сорбентов и систем растворителей.(5)

Так, для разделения гидрокси- и алкоксикумаринов, замещенных в бензольном цикле, предлагается применять колонку, заполненную силикагелем, и проводить последовательное элюирование гексаном, смесью гексан -- хлороформ (с увеличением концентрации хлороформа), смесью хлороформ -- метанол (9:1; 8:2; 7:3) или смесью хлороформ -- этанол (97:3) . В других случаях для этих же целей берут оксид алюминия и смесь этилацетат -- бензол (2:1) или бензол, силикагель и системы: хлороформ -- бензол (1:1), хлороформ, хлороформ -- этанол (98:2; 99:1; и т.д. до 90:10), бензол - бутанол (4:1; 3:1). Для разделения 4-фенил, 4-н-пропилкумаринов и 4-н-пропил-пиранокумаринов используют силикагель и элюируют последовательно системами гексан -- этилацетат (градиент), метанол -- вода -- дихлорэтан, гексан -- ацетон.

Фурокумарины фракционируют на оксиде алюминия (III степень активности) при помощи петролейного эфира, смеси петролейный эфир - хлороформ (2:1), хлороформа, смеси хлороформ -- этанол (9:1, 4:1, 2:1), а также на силикагеле -- смеси гексан -- хлороформ и хлороформ -- этанол с постепенным увеличением содержания более гидрофильного компонента.

О присутствии кумаринов свидетельствует характерная флуоресценция в УФ-свете отдельных зон сорбента, содержащих эти соединения, или же положительный эффект химических реакций, проводимых с элюатами.

При слабом сродстве вещества к сорбенту необходимо использовать активные слои и слабополярные растворители, а при сильном -- малоактивные слои и сильнополярные растворители. В частности, кумарины с фенольными или спиртовыми гидроксилами активнее сорбируются на окиси алюминия и элюируются большими объемами полярных растворителей (этанол), иногда с добавлением 0,5 % уксусной или хлористоводородной кислоты; метилированные производные и пиранокумарины слабее удерживаются на сорбенте. В процессе элюирования целесообразно постепенно заменять гидрофобные растворители гидрофильными.

Для разделения суммы кумаринов, в том числе при их сочетании с другими низкомолекулярными БАВ, их очистки и анализа в настоящее время предложена колоночная хроматография с использованием сорбентов аффинного типа на основе фенольных и полифенольных лигандов. Рекомендованы эпоксиактивированные сорбенты с матрицей HW-35, содержащей резорциновые и катехиновые лиганды. В качестве подвижной фазы используются вода, водные растворы этанола, минеральных кислот, нейтральных солей и различных их сочетаний. Установлено, что при использовании данных типов сорбентов результаты значительно превосходят те, которые были получены при использовании классических кремнеземных, полиамидных и декстрановых сорбентов.

Контроль за эффективностью колоночной хроматографии осуществляется с использованием бумажной (БХ), а чаще -- тонкослойной (ТСХ) хроматографии, что позволяет быстро устанавливать однородность исследуемых веществ и обнаруживать даже незначительные их количества. Для ТСХ наиболее часто применяются пластинки Силуфол или Сорбфил, иногда используется оксид алюминия II степени активности, силикагель, а в качестве систем растворителей -- смеси бензола и ацетона (1:2), бензола, метанола и ацетона (8:2:10), гексана и хлороформа, толуола и н-бутанола (гидрокси- и метоксикумарины), спирта этилового и хлороформа (5,5:4,5), хлороформа и формамида (скополетин), этилацетата и бензола (1:2), диэтилового и петролейного эфира (фурокумарины) и другие.

Наилучшим сорбентом для разделения суммы кумаринов методом ТСХ считается оксид алюминия, при этом в качестве элюентов используют смеси: петролейный эфир -- этилацетат (2:1), петролейный эфир -- хлороформ, циклогексан -- этилацетат (3:1), бензол -- этилацетат в различных соотношениях и бензол.

В бумажной хроматографии используются различные марки бумаги. Следует отметить, что ввиду избирательной растворимости кумаринов в водных и неполярных растворителях, применяется метод импрегнирования хроматографической бумаги 20 % водными растворами этиленгликоля или пропиленгликоля, раствором формамида (или диметилформамида) в метаноле или ацетоне, растворами бората или фосфата натрия. В первом случае гидроксилсодержащие кумарины остаются на линии старта, поэтому используется пропитывание бумаги другими растворами или проводится хроматографирование в системе БУВ без импрегнирования бумаги .

Детекция кумаринов на хроматограммах чаще всего проводится по флуоресценции в УФ-свете при характерных длинах волн до и после обработки хроматограммы водно-спиртовыми растворами гидроксида калия, парами аммиака, а также по другим цветным реакциям. Цвет флуоресценции не позволяет с достаточной степенью точности определить структуру кумаринов, но в ряде случаев по нему можно судить о наличии и примерном расположении функциональных группировок.

Индивидуальные вещества выделяют с использованием препаративной ТСХ. Идентичность выделенного вещества устанавливают по таким характеристикам, как температура плавления, ИК-, ЯМР- и масс-спектры . ИК-спектры кумаринов имеют характерные полосы поглощения при 1750-1700 см -1 (-С=О группы) и при 1620- 1470 см -1 (для -С=С- ароматического кольца). При исследовании кристаллической структуры синтетических веществ данного класса возможно использование кристаллографического анализа с применением программного обеспечения SHELXL97. В качестве характеристики кумаринов с боковой цепью, содержащей асимметрические атомы углерода, хиральных атомов углерода фуранового цикла замещенного дигидроангелицина и пиранового цикла замещенного келлактона может использоваться величина удельного вращения.

Для подтверждения структуры выделенных из растений кумаринов возможно использование встречного синтеза. Среди методов синтеза следует отметить конденсацию Перкина (из салицилового альдегида и уксусного ангидрида), реакции Пехмана (из фенола и яблочной кислоты или Р-кетоэфиров), реакцию Кневе-нагеля (конденсация о-гидроксибензальдегидов с эфирами малоновой и других кислот).(7)

Страницы: 1, 2, 3