Значительно лучшие результаты достигаются при использовании зорбакса PSM, получаемого по особой технологии. Этот сорбент выпускают с тремя размерами пор, перекрывающих диапазон молекулярных масс от 102 до 2-106. Для снижения адсорбции при работе в органических растворителях его поверхность силанизируют, а в водных системах используют не обработанный сорбент. Зорбакс PSM характеризуется исключительной однородностью пор, что в сочетании с малым диаметрОМ частиц и их умеренно узким распределением по размеру обеспечивает высокую эффективность колонок.

Комбинация колонок с зорбаксами PSM-60 и PSM-1000 дает линейную калибровочную зависимость в диапазоне от 2-102 до 2-106. Фирмой «Дюпон» выпущены «тримодальные» колонки, содержащие смесь зорбаксов PSM-60, PSM-300 и PSM-3000, с линейной калибровочной зависимостью в пределах 102-107 Для обеспечения необходимой селективности разделения' рекомендуется использовать наборы из двух и более колонок. Зорбакс PSM, видимо, является лучшим из жестких сорбентов, не дназначенных для исследования биополимеров. Калибровочные кривые для жестких сорбентов по полистиролу в тетрагидрофуране приведены на рис. 8.

Пористые стекла в немодифицированном виде в последнее время применяют редко, так как они обладают значительно большей адсорбционной активностью, чем силикагель. Отличительной особенностью пористых стекол является чрезвычайно узкoe распределение пор по размеру, поэтому они характеризуются очень высокой селективностью разделения, но в малом диапазоне молекулярных масс.

К сорбентам для высокоэффективной эксклюзионной хроматографии белков, ферментов и других биологических объектов предъявляются значительно более жесткие требования по инертности поверхности, чем к сорбентам для разделения синтетических полимеров. Кислые силанольные пруппы силикагеля обладают высокой адсорбционной активностью, проявляют слабые ионообменные свойства и способны денатурировать белковые молекулы. Поэтому поверхность жестких сорбентов очень тщательно модифицируют прививкой монослоев нейтральных гидрофильных органических гpyпn. К таким сорбентам относятся ц-бондагель Е и материалы, содержащие глицерильные группы. Поверхность ц-бондагеля Е модифицирована алифатически-ми эфирными группами. Колонки с этим сорбентом можно использовать с любыми растворителями от пентана до буферных растворов в области рН от 2 до 8. Они характеризуются высокой разрешающей способностью, но из-за малого рабочего объема (примерно 1,2 мл на колонку) требуется особо точная подача подвижной фазы.

Качество получаемых сорбентов во многом определяется полнотой реакции. Теоретически в указанную реакцию может вступить примерно половина всех силаноль-ных групп. Однако оставшиеся группы не могут взаимодействовать с сорбентами, так как экранируются глицерильными группами. При недостаточной степени покрытия полного экранирования не пооисходит и начинает проявляться «силанольная активность» незамещенных групп. Содержание таких активных групп, характеризующее уровень дезактивации сорбентов, часто оценивают по степени сохранения ферментативной активности лабильных ферментов после их пропускания через хроматографическую колонку.

Наиболее известными представителями материалов указанного типа является гликофаза CPG, получаемая из пористых стекол марки CPG (Controlled Porous Glass), лихросфер диол и синхропак GPC. Эти гели характеризуются весьма высокой инертностью: так, потеря ферментов при хроматографировании на лихросфере диол обычно не превышает 2-7%. Сорбенты синхропак GPC, по данным фирмы, обеспечивают полное сохранение ферментативной активности.

Наилучшими свойствами для эксклюзионной хроматографии биополимеров обладают TSK-гели типа SW. Поверхность этих материалов покрыта гидрофильными ОН-грутопами по особой технологии, обеспечивающей исключительную инертность сорбента, практически не уступающую сефадексу. Поэтому эксклюзионное разделение, как правило, не осложняется побочными сорбционными процессами. TSK-гели SW выпускают с тремя размерами пор; и они перекрывают диапазон молекулярных масс от 5*102 до 4*105 (по декстрану) или до 106 (по глобулярным белкам). За счет большого объема пор колонки, с этими гелями характеризуются высокой разделительной способностью, а их гарантированная эффективность составляет 16 тыс. т.т./м.

Хотя подавляющее большинство разделений на жестких гелях с привитыми гидрофильными группами проводят в водных системах, эти материалы могут быть использованы и в сочетании с полярными органическими элюентами (тетрагидрофуран, диметилформамид, этанол), что расширяет возможности их применения.

Успехи, достигнутые за последние несколько лет при разработке сорбентов для высокоэффективной эксклюзионной хроматографии, позволяют предполагать, что в скором времени будут созданы новые материалы с еще более высокими характеристиками.

Сорбенты для ионообменной хроматографии

В ионообменной хроматографии применяют разнообразные сорбенты, используемые как для разделения белков, так и для разделения неорганических ионов и небольших молекул. Эти сорбенты можно разделить на при основных вида: ионообменные смолы, пелликулярные материалы и силикагель с химически привитой фазой, обладающей ионообменными свойствами. Пелликулярные сорбенты в настоящее время практически не применяют, их используют лишь для заполнения предколонок и при воспроизведении старых методов.

Применяемые в ВЭЖХ ионообменные смолы, как правило, являются сополимерами стирола и дивинилбензола, к которым привиты ионные функциональные группы.

Синтетические смолы являются гелями, каркас которых или матрица состоят из сети пространственно закрепленных между собой углеродных цепей. С матрицей жестко соединены фиксированные ионы, несущие заряд и придающие смоле свойства ионообменника. Сама матрица гидрофобна, а гидрофильные фиксированные ионы придают ей способность к набуханию, превращая смолу в полуэлектролит. Набухаемость смолы зависит от числа поперечных связей в молекуле или сшивки.

Твердость и механическая прочность сополимера стирола и дивинилбензола также зависит от степени сшивки, т.е. от процентного содержания дивинилбензола. Ионообменная смола с высокой степенью сшивки, содержащая 8-12% дивинилбензола, способна не изменять объем в различных растворителях и выдерживать большие давления без сжатия (усадки).

Обычно ионообменные смолы представляют собой микропористые сферические частицы диаметром менее 10 мкм. Сульфо-группы придают им способность к катионному обмену, а триалкиламмониевые - к анионному. Они обладают приемлемой эффективностью и высокой ионообменной емкостью. Емкость различных смол колеблется от 3 до 10 ммоль/г.

Эти материалы находят ограниченное применение из-за сравнительно низкой эффективности, что связано с очень медленной диффузией молекул образца в микропоры полимера. К достоинствам этих смол следует отнести стабильность и селективность.

Основные ионообменные смолы, применяемые в ВЭЖХ, и их характеристики приведены в приложении 2.

Интересны ионообменные хелатные смолы, которые могут связывать ионы некоторых металлов, образуя с ними комплексы более прочные, чем с ионами других металлов. Селективность смолы можно улучшить, изменяя кислотность среды. Смола ХАД-4 имеет большое число пор диаметром 50 нм и удельную поверхность 780 м2/г. Ионообменная хелатная смола хелекс 100 содержит функциональную группу иминодиуксусной кислоты - CH2N(CH2COO) 2

Другим типом сорбента, ранее применявшимся в ионообменной хроматографии, являются те же ионообменные смолы, нанесенные на пелликулярные частицы или привитые к ним. Поверхностно-пористые или пелликулярные материалы имеют тонкую пленку ионообменной смолы, обычно 1-3 мкм толщины, нанесенную на частицы диаметром 40 мкм. Во всех случаях диффузия в тонком слое увеличивается и эффективность колонки возлегает, однако ионообменная емкость резко падает. Максимальная емкость колонки размером 2 мм Х 25 см, заполненной пелликулярной ионообменной смолой, составляет около 1 мкг. дя работы с пелликулярными материалами пригодны лишь фотометры и спектрофотометры. Эти материалы применяют в основном в качестве сорбента для заполнения предколонок, так как набивку ими можно проводить «сухим» способом.

Добиться высокой эффективности разделения удалось при использовании микрочастиц полностью пористого силикагеля, которому равномерно привита фаза, имеющая ионообменные группы. Силикагелевая основа делает материал более прочным. Проблемы набухания или усадки колонки редко возникают. Материал устойчив к любым буферным растворам, растворителям и высоким температурам (до 80 °С). Однако сильнокислотные или слабоосновные растворы (2>рН>7,5) могут привести разрушению силикагелевой основы. Как правило, эффективность, полученная на привитых ионообменниках, сравнима с эффективностью обращенно-фазных материалов одинакового зернения.

Коммерческие ионообменные силикагели различаются по структуре пор и по типу присоединенной функциональной группы, по общей поверхности пор и форме частиц. Активные группы вводят сульфированием, хлорметилированием и последующим минированием. Даже если поверхность силикагеля полностью покрыта кремнеорганическими соединениями, остается большое число непрореагировавших поверхностных ОН-групп, которые ведут себя как слабые кислоты в ионообменном процессе. Вследствие этого основные ионообменники, привитые на силикагель, являются бифункциональными. К силикагелю прививают следующие группы: кислотные-карбокси-, сульфодиол-; основные - амино, алкил-амино; амфотерные аминоокси- или аминокарбокси- Обычно силикагель обрабатывают фенилтрихлорсиланом, затем сульфируют олеумом или хлорсульфоновой кислотой. Трифенилсилильная группа более устойчива к сульфированию, чем фенил или нафтилсилильная.

В силикагелях-материалах, доступных как образцу, так и противоиону, быстро устанавливается массопередача, что приводит к высокой эффективности колонки. Силикагели с привитыми группами делятся на микро- и макропористые в зависимости от диаметра внутренних пор. Микропористые материалы, имеющие небольшие по диаметру поры, позволяют молекулам растворителя, например воды, а также небольших ионов проникать в полимерную матрицу и задерживают большие молекулы. Большинство полимерных ионообменных силикагелей имеют микроструктуру. Полимерные смолы макропористого типа зачастую используют в жидкостной хроматографии низкого давления. Макропористые силикагели с привитыми ионообменными группами стали применять при разделении больших молекул, наnpимеp белков. Однако устойчивость сорбента невелика из-за растворения его в водной подвижной фазе.

Литература

Ohmacht R., Halasz /./Chromatographia, 1981, v. 14, p. 155-161, p. 216 - 226.

Engelhardt H., Muller Я./J. Chromatogr, 1981, v. 218, p. 395-407.

Bredeveg R.A., Rothman L.D., Pfeiffer C.D./Anal Chem, 1979, v. 51, No. 12, p. 2061-2063.

Nice E. С., О'Нага M.J./J. Chromatogr, 1978, v. 166, p. 263-267.

Atwood J.G., Goldstain J./J. Chromatogr. Sci, 1980, v. 18, p. 650-654.) 6. Pearson J.D., Lin N. Т., Regnier F.E./Anal Biochemistry, 1982, v. 124, p. 217-230.

Rimer J., McKlintock R., Galyean R. e. a./J. Chromatogr, 1984, v. 288, p. 303-328.

Rimer L, McKlintock R./J. Chromatogr, 1983, v. 268, p. 112-119.

Wise S.A., Bonnett W.J. e. a./J. Chromatogr. Sci, 1981, v. 19, p. 457 - 465.

Страницы: 1, 2