Экстракцию липидов проводили смесью хлороформ-метанол (2:1) по методу Блайера и Дайера (Bligh E.G.. Dyer W.J, 1959).

Определение содержания глюкозы в культуральной жидкости проводили глюкозооксидазным методом (Beyrich Т., 1965).

Бактериородопсин выделяли из пурпурных мембран Н. halobium ET 1001 по методу Остерхельда и Стохениуса (Oesterhdt О., & Stohenius, 1976).

Гидролиз белка проводили с использованием 4 н. Ва(ОН): и 6 н. DC1 ( в D2О)(110°С,24ч).

Бензилоксикарбонильные производные аминокислот получали в ходе реакции Шоттена-Баумана (GreensteinJ., Winitz M., 1961).

Дансильные производные аминокислот получали по методу Греема и Хартли (GreemB., Hartly В, 1963).

Метиловые эфиры дансил-аминокислот получали по методу Физера (Fiser J., 1963).

Аналитическое и препаративное разделение бензилоксикарбонильных производных аминокислот проводили методом обращённо-фазовой ВЭЖХ, разработанным Егоровой Т. А. (Егорова Т.А., 1993).

Разделение метиловых эфиров дансил-аминокислот проводили на жидкостном хроматографе "Кпаиег" (ФРГ), снабженным УФ-детектором "2563" и интегратором "C-R ЗА" (Shirnadzu, Япония). Неподвижная фаза: Separon SGX С 18,1 мкм, 150 х 3,3 мм (Kova, Чехословакия). Использовали градиентное элюирование растворителями: (А) - ацетонитрил-трифторуксусная кислота (20:80 об/об) и (В) - ацетонитрил (от 20% В до 100% В в течение 30 мин, при 100% В в течение 5 мин, от 100% В до 20% В в течение 2 мин, при 20% В в течение 10 мин),

Ионнообменную хроматографию проводили па приборе "Biotronic LC 500!" (ФРГ), 230x3,2 мм, рабочее давление 50-60 атм, скорость подачи буфера 18,5 мл/ч, нингидрина 9,25 мл/ч, детекция при 570 нм и 440 нм.

Масс-спектры электронного удара получены на приборе "МВ-80А " (Hitachi, Япония) при энергии ионизирующих электронов 70 эВ. Масс-спектры FAB были получены на приборе " MBA " (Hitachi, Япония) при ионном токе 0,6-0,8 мА.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

1. ПОЛУЧЕНИЕ ШТАММОВ-ПРОДУЦЕНТОВ БАС, АДАПТИРОВАННЫХ К

РОСТУ И БИОСИНТЕЗУ НА СРЕДАХ С МАКСИМАЛЬНЫМИ

КОНЦЕНТРАЦИЯМИ ТЯЖЁЛОЙ ВОДЫ.

Адаптация облигатных метилотрофных бактерий М. flagellatum. В связи с важностью препаративного аспекта получения дейтерий-меченных соединений в рамках данной работы была изучена возможность адаптации различных штаммов-продуцентов БАС к росту на средах с максимальными концентрациями тяжелой воды (D2O). Для этого были проверены представители различных таксономических групп метилотрофных бактерий, имеющихся в коллекции ГосНИИ Генетики: L-лейцин-продуцирующий штамм облигатных метилотрофных бактерий М. flagellatum (ileu), реализующий 2-кего-3-дезокси-6-фосфогдюконат-альдолазный (КДФГ) вариант рибулё'зо-5- монофосфатного (РМФ) цикла ассимиляции углерода и L-фенилаланин-продуцирующий штамм факультативных метилотрофных бактерий В. methylicum (leu), ассимилирующий метанол по РМФ- циклу.

Для проведения адаптации был выбран ступенчатый режим увеличения концентрации тяжёлой воды в ростовых средах, так как мы предположили, что постепенное привыкание организма к тяжёлой воде будет оказывать благоприятный эффект на скорость роста культуры. При этом штамм М. flagellatum обнаружил повышенную чувствительность к тяжёлой воде: ингибирование роста бактерий наблюдалось при концентрациях D2О в среде 74,5 об.%. Роста бактерий на более высокой концентрации тяжёлой воды достичь не удалось. В связи с этим, в экспериментах по изучению уровней включения дейтерия в аминокислоты использовали препараты культуральной жидкости и биомассы М. flagellatum, полученные со среды, содержащей 74,5 об.% тяжёлой воды. Концентрация экзогенного дейтерометанола CD3OD составляла, как обычно, 1 об.%.

Адаптация факультативных метилотрофных бактерий В. methylicum. Попытки адаптировать штамм В. methylicum к росту при сохранении способности к биосинтезу L-фенилаланина на максимально дейтерированной среде привели к желаемому результату. К данному штамму метилотрофных бактерий был применён специально разработанный нами подход по адаптации, который заключался в серии из пяти адаптационных пассажей исходной культуры на агаризованных средах (с добавкой 2 об. % дейтерометанолом CD3OD) при ступенчатом увеличении концентраций экзогенной тяжёлой воды (от 0; 24,5; 49,0; 73,5 об% до 98 об% D2O) и последующей селекции устойчивых к тяжёлой воде клонов бактерий. При этом последовательно отбирали отдельные колонии, выросшие на средах, содержащих тяжёлую воду. Затем их пересевали на среды с большей степенью дейтерированпости, включая среду с 98 об.% тяжёлой водой (степень выживаемости бактерий на конечной полностью дейтерированной среде составляет не более 40%).

Полученный результат в опытах по адаптации В. methylicum к тяжёлой воде, позволил использовать гидролизаты его биомассы, а также саму биомассу, полученную в ходе многоступенчатой адаптации к D2O в качестве полноценных ростовых субстратов для выращивания бациллярных штаммов В. subtillis и В. amytoliquefaciens, а также штамма галофильных бактерий Н. halobium ET1001.

Адаптация бацилл В. subtittis и В. amyloliqucfaciens. В следующих опытах была исследована способность к росту на тяжёлой воде бациллярных штаммов В. subtillis (his, tyr, ade, иrа), и В. amyloliquefaciens (ade, иrа), продуцентов инозина и тимидина, соответственно. Мы предположили, что замедление роста бактерий на минимальных средах, содержащих тяжёлую воду могло быть обусловлено появлением ауксотрофности по отдельным ростовым факторам. Чтобы проверить это предположение, в дальнейшем мы использовали комплексные среды. Как и предполагалось, обе культуры удалось адаптировать к дейтерию путём рассева на твёрдые среды, приготовленные из 99,9 ат.% тяжёлой воды. Они сразу обнаружили нормальный рост на тяжёлой воде. У штаммов В. subtilis и В. amyloliquefaciens при росте на тяжёлой воде было отмечено сохранение высокого уровня продукции по инозину и тимидину (3,9 и 3,0 г/л соответственно).

Адаптация галофильных бактерий Н. halobium ET 1001. В случае с Н. halobium ET 1001 адаптацию проводили как на агаре, содержащим 99,9 ат.% тяжёлую воду путём рассева штамма до отдельных колоний, так и на жидкой среде с тяжёлой водой. В обычных для этой бактерии условиях культивирования (37°С, на свету) в клетках синтезировался фиолетовый пигмент по всем характеристикам не отличающийся от нативного бактериородопсина.

2. ИЗУЧЕНИЕ РОСТА И БИОСИНТЕЗА БАС ПОЛУЧЕННЫМИ ШТАММАМИ

Изучение ростовых характеристик М. jlagellatum на средах, содержащих CH3OH/CD3OD и D2O, а также 13СНзОН. Данные по росту штамма М. Jlagellatum на минимальных средах с добавкой 1 об.% метанола СНзОН и его меченных аналогов (СDзOD/13СНзОН) и содержащих ступенчато увеличивающиеся концентрации тяжёлой воды приведены в таблице I. Как видно из таблицы I, на средах, содержащих тяжёлую воду и изотопные аналоги метанола - дейтеро-метанол CD3OD и 13С-метанол 13CH3OH, выходы микробной биомассы составили 81% и 72% соответственно, а на средах с 74,5 об.% тяжёлой водой выход биомассы составил 29%, что в 3,4 раза ниже, чем в контрольных экспериментах, когда использовали обычную воду и метанол СНзОН (табл. 1, опыты 1,3,8). Как видно, способность к росту у М. flagellatum сохранялась лишь в среде, содержащей 74,5 об.% тяжёлой воды. Выше этой концентрации наблюдалось ингибирование скорости роста бактерий.

Таблица 1. Влияние изотопного состава среды на рост штамма M.flagelaum.

Как и следует из литературных данных (Складнее Д. А, 1990), введение стабильного изотопа углерода |3С не приводит к летальным последствиям для клетки, что мы и наблюдали в случае с М. flage/talum. В целом, полученные для М. flagellatum данные могут свидетельствовать о том, что адаптация к тяжёлой воде определяется как видовой специфичностью метилотрофных бактерий, так и особенностями их метаболизма. Кроме этого, из таблицы 1 следует, что данный подход можно эффективно использовать для введения в синтезируемые БАС двойной изотопной метки (дейтерий- и изотоп углерода 15C).

Изучение ростовых и биосинтетических характеристик Б. methylicum на средах, содержащих CH3OH/CD3OD и D2O. Данные по росту исходного и адаптированного к тяжёлой воде штамма В. methylicum и максимальному уровню накопления L-фенилаланина в культуральной жидкости на минимальных средах с добавкой 2 об.% метанола и его дейтерированного аналога СН3OН/CD3OD, содержащих ступенчато увеличивающиеся концентрации тяжёлой воды, представлены в таблице 2. Как видно из табл. 2, в отсутствии дейтерий-меченных субстратов продолжительность лаг-фазы не превышала 24 ч (см. табл. 2, опыт 1). С увеличением концентрации тяжёлой воды в среде продолжительность лаг-фазы увеличивалась до 64,4 ч на средах с 98 об.% тяжелой водой и 2 об.% CD3OD (табл. 2, опыт 10). Отмечено, что длительность времени клеточной генерации с увеличением степени изотопного насыщения среды дейтерием постепенно увеличивается, достигая 4,9 часов на максимально дейтерированной среде (табл. 2, опыт 10).

Страницы: 1, 2, 3, 4, 5