|
Прежде всего возникают два вопроса:
1. Как распознавать клоны, содержащие гибридную ДНК,
среди потомства трансформированных клеток или живых бактериофагов ?
2. как идентифицировать необходимые фрагменты ДНК
среди многих клонированных неизвестных фрагментов?
Например можно отбирать бактериальные клетки, если они несут плазмиду с
фактором устойчивости к антибиотику, выращивая их на среде, на среде,
содержащей антибиотик. Нетрансформированные клетки без плазмид(и,
следовательно, без гена устойчивости к антибиотику) просто не будут расти на
такой среде. В последнее время разработано много специальных методов
вакцинации, которые позволяют отбирать только рекомбинантные клетки.
Для генной инженерии белков недостаточно отобрать и размножить определённые
фрагменты ДНК, необходимо ещё индуцировать их экспрессию в клетке. Для этого
необходимо «подключить» рекомбинантную молекулу ДНК , последующую трансляцию
матричной РНК и процессинг как на транскрипционном , так и на трансляционных
уровнях.
1.4. ИДЕНТИФИКАЦИЯ И АНАЛИЗ ГЕНОВ.
Ещё одна область применения рестриктаз – идентификация и определение числа
генов. Эти задачи решаются с помощью метода разработанного Саузерном.
Тотальную ДНК из клеток человека гидролизуют эндонуклеазой примерно на 500000
фрагментов длиной от 102 до 105 нуклеотидных пар. Затем
фрагменты разделяют по молекулярной массе с помощью гель- электрофореза в ага
розе, после чего ДНК денатурирует с щелочью прямо в геле, чтобы получить
одноцепочные фрагменты. Их переносят на нитроцеллюлозный фильтр и фиксируют
высушиванием при 800С. В результате получается отпечаток(реплика)
картины разделения фрагментов ДНК по их размеру. Эти фрагменты можно
идентифицировать методом гибридизации с радиоактивными ДНК-зондами,
специфичными для определённых генов или хромосом. Любой фрагмент, содержащий
всю последовательность зондируемого гена или его часть, будет выглядеть на
радиоавтографе в виде тёмной полосы.
Зонды и генные библиотеки. Главное условие такого анализа - наличие
подходящего геноспецифического радиоактивного ДНК-зонда, который можно
использовать для гибридизации.
1.5. ГИБРИДИЗАЦИЯ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ.
Способность к гибридизации цепей ДНК лежит в основе многих методических
приёмов молекулярной биологии, поэтому более подробное описание принципа
гибридизации будет полезным. Большинство природных ДНК встречается в виде
двухцепочных молекул. Их устойчивость поддерживается благодаря тому, что
пиримидиновое основание цитозин(C) спаривается с пуриновым основанием
гуанином(G), в то время как пиримидиновое основание тимин(T) спаривается с
пуриновым основанием аденином(A). Эти комплиментарные пары оснований
удерживаются водородными связями(тремя в паре G-C и двумя в паре A-T),
которые относительно легко разрываются, при этом одноцепочные фрагменты ДНК,
присутствующие в растворе, снова формируют двойную спираль. Для реассоциации
не имеет значения происхождения одноцепочной ДНК, не требуется даже полной
комплиментарности отдельных цепей. Реассоциация происходит даже тогда, когда
какая-то часть оснований в каждой цепи не комплиментарна. Одноцепочная ДНК
может спариваться,то есть гибридизироваться даже с РНК, если у них есть
комплиментарные основания.
"ПРОГУЛКА ПО ХРОМОСОМЕ". Метод гибридизации полезно
использовать, например, для анализа очень протяженного гена. При этом с
помощью подходящего зонда из геномной библиотеки ДНК первоначально
извлекается какая-то часть такого гена. Нуклеотидная последовательность этой
части гена будет, как правило, длинее зонда, и её концы будут перекрываться с
другими фрагментами данного гена в этой библиотеке,то есть будут, по крайней
мере, частично гибридизироваться с ними. Свободные концы этих фрагментов
будут гибридизироваться со следующими и так далее, пока весь структурный ген
не будет полностью идентифицирован серией перекрывающихся фрагментов. Именно
таким образом был реконструирован структурный ген фактора свертывания крови
VII человека, необычно длинный, состоящий из 180000 пар нуклеотидов.
Существующий метод гибридизации in situ, этот метод уже усовершенствован на
столько, что с его помощью можно локализовать в хромосомах даже уникальные
гены, такие как ген инсулина. Вот пример некоторых генов человека,
идентифицированных с помощью гибридизации(таблица 1).
ТАБЛИЦА 1.
Некоторые гены человека, идентифицированные с помощью гибридизации.
Ген, длина последовательности ДНК и число копий. | Локализация. | | ________________3__11 ρ | | | ________________l__ 16 ρ | | | Инеулин(900 п.н.) | 11 ρ 15 | | Интерферон | 9 ρ 2,1 - pter | | Онтоген fes(4000 п.н.) | 15 q 2,4 - gter | | Сывороточный альбулин(1600 п.н.) | 4 q 11 - 22 | | Миозин МНС(2200 п.н.) | 17 ρ1,2 - pter | | Колаген(COL 1A2) | 7 q 22 |
1.6. СОРТИРОВКА ХРОМОСОМ.
Следующий метод – это метод сортировки хромосом при опмощи цитофлюрометрии.
Этот метод может быть использован в двух разных целях:
1) Для идентификации и количественного анализа большого числа хромосом в
течение очень короткого времени.
2) для препаративного разделения хромосом. Этот метод имеет два преимущества
перед стандартными методами анализа хромосом:
- во-первых, он полностью автоматический, благодаря чему
исключается элемент субъективности
- во-вторых, он намного быстрее (рис.3)
Однако важнее, что этот метод позволяет препаративно разделять хромосомы, и
при наличии специфических зондов исследовать структуру и функцию отдельных
генов становится относительно просто. В этом случае ген можно локализовать в
хромосоме с помощью гибридизации in situ, размножить его ДНК путём
клонирования и секвенирования.
Рис. 3. Принцип сортировки хромосом с помощью лазера. Хромосомы окрашены
флуоресцирующим красителем. Флуоресценция возбуждается лазерным лучом и
измеряется для каждой хромосомы отдельно. Данные измерений используют для
сортировки хромосом.
1.7. СЕКВЕНИРОВАНИЕ ДНК.
Последовательность нуклеотидов и генетический код.
Методы определённой последовательности аминокислот в полипептидной цепи были
известны ещё в 50-х годах. Теоретически это относительно лёгкая проблема,
поскольку все 20 аминокислот, встречающихся в природных белках, имеют разные
свойства. С другой стороны, нуклеотидная последовательность ДНК относительно
однородна по составу однородных звеньев, так как содержит только четыре типа
азотистых оснований – гуанин, цитозин, аденин и тимин. Когда в 60-е годы был
расшифрован генетический код, появилась возможность востанавливать
(дедуцировать) нуклеотидную последовательность соответствующего белка. Однако
генетический код является вырожденным, то есть одной и той же аминокислоте
соответствуют несколько нуклеотидных триплетов. Следовательно сведения о
нуклеотидной последовательности аминокислот в белке, не однозначны. Кроме
того последовательности аминокислот не содержат никакой информации о
последовательности некодирующих участков ДНК. Принцип состоит в следующем:
длинную молекулу ДНК фрагментируют при помощи агентов, расщепляющихся в
специфических сайтах. Затем определяют последовательность нуклеотидов в
каждом из этих фрагментов. Очерёдность фрагментов в целой молекуле
восстанавливают, используя перекрывающие концы: идентичные цепи разрезают
повторно другой рестриктазой, а затем последовательности, перекрывающихся
образующихся при обработке двумя рестриктазами разной специфичности,
сравнивают. Так может быть реконструирована полная последовательность. В
пределах отдельных фрагментов порядок нуклеотидов определяют с помощью
специальных методов. Раньше секвенирование ДНК было весьма трудным делом,
теперь же оно осуществляется очень легко и быстро. Для этого необходимо
длинную молекулу ДНК с помощью рестриктазы разделить на фрагменты удобного
размера, а затем, если нужно,мощью специальных методов. Раньше секвенирование
ДНК было весьма трудным делом, теперь же оно осуществляется очень легко и
быстро. Для этого необходимо длинную молекулу ДНК с помощью рестриктазы
разделить на фрагменты удобного размера, а затем, если нужно,ные сведения и о
нетранскрибирусных участках ДНК, важных для контроля транскрипции(так
называемые операторы и промоторы).
1.8.ДИНАМИЧНОСТЬ ГЕНОМА.
Методы новой гентики расширили наши знания о структуре генетического
материала. В 1963 году Тэйлор описал “индуцированные фагом мутации E. Coli”,
вкоре после этого, Старлингер и Седлер описали IS-элементов у бактерий. Эти
элементы получили название мобильных, теперь же они определяются как
специфические последовательности ДНК, которые могут неоднократно внедряться в
разные сайты генома. Перенос генов от одной бактерии к другой с помощью фага
(трансдукция) известен давно, а теперь используется и в генетической
инженерии эукариот (включая клетки млекопитающих). Возможно, такие процессы
могут происходить и в природе. Более того, последовательности ДНК,
гомологичные глобиновому гену человека, были обнаружены у бобовых растений.
Функция такого гена у растений может состоять в том, чтобы “обеспечить
кислородом клубеньковые бактерии в ткани”. Наличие этого гена может быть
объяснено переносом его от насекомых или млекопитающих.(рис.4).
Стр 142 рис 2.95
НАРИСУЕМ САМИ
Итак, из выше изложенного можно сделать следующее заключение, что
теоретическими предпосылками формирования генной инженерии как науки,
явились:
1. Открытие двойной спирали ДНК.
2. Получение информации о матричном синтезе:
- Репликации ДНК.
- Транскрипции ДНК.
- Трансляции ДНК.
3. Открытие плазмид.
4. Открытие фрагментов рестриктаз.
5. Осуществление процесса рекомбинации хромосом
6. Идентификация и анализ генов.
7. Способность к гибридизации цепей ДНК.
8. Секвенирование ДНК.
ГЛАВА 2. ВОЗМОЖНОСТИ ГЕННОЙ ИНЖЕНЕРИИ.
Значительный прогресс достигнут в практической области создания новых
продуктов для медицинской промышленности и лечения болезней человека
(табл.2).
ТАБЛИЦА 2.
Использование генно-инженерных продуктов в медицине.
| Продукт | Природные продукты и сфера применения генно-инженерных продуктов | | Антикоагуляторы | Активатор тканевого плазминогена (АТП), активирует плазмин. Фермент, вовлечённый в рассасывание тромбов; эффективен при лечении больных инфарктом миокарда. | | Факторы крови | Фактор VIII ускоряет образование сгустков; дефицитен у гемофиликов. Использование фактора VIII, полученного генно-инженерными методами, устраняет риск связанный с переливанием крови. | | Факторы стимулирующие образование колоний | Ростовые факторы иммунной системы, которые стимулируют образование лейкоцитов. Применяют для лечения иммунодефицита и борьбе с инфекциями. | | эритропоэтин | Стимулирует образование эритроцитов. Применяют для лечения анемии у больных с почечной недостаточностью. | | Ростовые факторы | Стимулируют дифференциацию и рост различных типов клеток. Применяют для ускорения лечения ран. | | Гормон роста человека | Применяют при лечении карликовости. | | Человеческий инсулин | Используется для лечения диабета | | Интерферон | Препятствует размножению вирусов. Также используется для лечения некоторых форм раковых заболеваний. | | Лейксины | Активируют и стимулируют работу различных типов лейкоцитов. Возможно применение при залечивании ран, при заражении ВИЧ, раковых заболеваний, иммунодефиците. | | Моноклональные антитела | Высочайшая специфичность связанная с антителами используется в диагностических целях. применяют также для адресной доставки лекарств, токсинов, радиоактивных и изотопных соединений к раковым опухолям при терапии раков, имеется много других сфер применения. | | Супероксид дисмутаз | Предотвращает поражение тканей реактивными оксипроизводными в условиях кратковременной нехватки кислорода, особенно в ходе хирургических операций, когда нужно внезапно восстановить ток крови. | | Вакцины | Искуственно полученные вакцины (первой была получена вакцина против гепатита В) по многим показателям лучше обычных вакцин. |
Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6
| 
