аутофосфорилированию, он дважды пронизывает внутреннюю мембрану бактериальной

клетки и выступает в качестве донора фосфора белку VirG. Фосфорилированный

VirG активирует транскрипцию остальных vir-генов. Индукция vir-генов

обратима, что очень важно для патогена: в случае, если хозяин - больной и

нежизнеспособный организм, перенос Т-ДНК не осуществляется.

Оперон VirD кодирует несколько продуктов. Один из них является

двухкомпонентной эндонуклеазой. Область Т-ДНК окружена одинаковыми повторами

длиной 25 пар оснований. Эти последовательности являются сайтами узнавания

VirD-эндонуклеазы, режущей точно между 3-м и 4-м основаниями 25 пар оснований

повтора. Эта эндонуклеаза ответственна за вырезание Т-ДНК. Белки VirB и VirE

необходимы для транспорта Т-ДНК из бактерии в растение. Перенос Т-ДНК из

бактерии в цитоплазму растительной клетки осуществляется за 30 мин.

Внедрение Т-ДНК в растительный геном является многоступенчатым процессом.

Недавние результаты анализа нуклеотидных последовательностей в участках

растительной ДНК, в которые инкорпорируется Т-ДНК, показали, что есть

гомология между растительной ДНК по обеим сторонам от места встраивания и

наружными областями плазмидной ДНК агробактерий. В геном растения могут

встраиваться несколько копий Т-ДНК. После встраивания в хромосому Т-ДНК

становится обычной частью генома растения. Т-ДНК транскрибируется в

растительных клетках РНК-полимеразой II растения-хозяина. Транскрипты имеют

особенности эукариотических матриц. Сама бактерия в клетку не проникает, а

остается в межклеточном пространстве и использует растительные клетки со

встроенной Т-ДНК как фабрику, продуцирующую опины - источник азота и

углерода.

2.6. ДНК Ti-ПЛАЗМИДЫ МОЖНО ИСПОЛЬЗОВАТЬ В КАЧЕСТВЕ ВЕКТОРА

Т-ДНК Ti-плазмид обладает двумя свойствами, делающими ее по существу

идеальным вектором для введения чужеродных генов в клетки растений. Во-

первых, круг хозяев агробактерий очень широк: они трансформируют клетки

практически всех двудольных растений. Известно, что можно добиться заражения

однодольных, в том числе злаков. Во-вторых, интегрированная в состав генома

растения Т-ДНК наследуется как простой доминантный признак в соответствии с

законами Менделя, а ее гены имеют собственные промоторы (регуляторная область

гена, определяющая время и место его экспрессии), под контролем которых могут

экспрессироваться вставленные в Т-ДНК чужеродные гены.

Простейший способ введения Т-ДНК в клетки растения состоит в том, чтобы

заразить его A. tumefaciens, содержащей подходящую Ti-плазмиду, и

предоставить дальнейшее естественному ходу событий. Необходимо только уметь

встраивать нужные гены в Т-сегмент ДНК плазмиды. Однако размеры целой Ti-

плазмиды существенно больше размеров молекул, обычно используемых в работе с

рекомбинантной ДНК. Чтобы преодолеть эту трудность, разработан следующий

подход. Прежде всего Т-сегмент вырезают из Ti-плазмиды с помощью рестриктаз и

встраивают в один из стандартных плазмидных векторов для размножения в

клетках бактерий - Escherichia coli. E. сoli содержит плазмиду pBR322,

которая способна к саморепликации, то есть размножению, приводящему к

увеличению числа ее копий. После того как в плазмиду pBR322 внедрили участок

Ti-плазмиды, это рекомбинантная структура может затем реплицироваться

многократно, что приводит к увеличению числа копий участков Ti-плазмиды. Этот

процесс называется клонированием. Бактерии, содержащие плазмиду pBR322 с

участком Т-ДНК, размножают, после чего эту плазмиду выделяют. Затем с

использованием рестриктаз и стандартных приемов работы с рекомбинантной ДНК в

Т-сегмент встраивают определенный ген. Этот молекулярный гибрид, теперь уже

содержащий Т-ДНК со встроенным в нее геном, снова размножают в E. сoli, а

затем вводят в клетки A. tumefaciens, несущие соответствующую полную Ti-

плазмиду. В результате обмена идентичными участками (гомологичная

рекомбинация) между Т-сегментами нативной и сконструированной Ti-плазмид Т-

ДНК со встроенным чужеродным геном включается в Ti-плазмиду, замещая

нормальную Т-ДНК. Таким образом, мы получаем клетки A. tumefaciens, несущие

Ti-плазмиду со встроенным в Т-сегмент нужным геном. Последний этап

заключается в заражении растений этими модифицированными генно-инженерными

методами агробактериями. Клетки полученных трансгенных растений будут

содержать интегрированную Т-ДНК со встроенным чужеродным геном, то есть цель

работы, состоявшая во введении данного гена в геном растения, будет

достигнута. Недавние исследования, однако, показали, что эту процедуру можно

упростить, если использовать бинарные векторные системы, создание которых

заключается в том, что агробактериальная клетка должна содержать по крайней

мере две разные модифицированные Ti-плазмиды. Одна из них должна содержать

только vir-область, гены которой будут участвовать в вырезании Т-ДНК. Такие

плазмиды называют плазмидами-помощницами. Вторая Ti-плазмида должна содержать

область Т-ДНК с нужным встроенным геном. Продукты vir-генов способны вырезать

Т-ДНК как на собственной плазмиде, так и на соседней, то есть vir-гены могут

работать вне зависимости от их местоположения. Таким образом, если клетки

агробактерии содержат Ti-плазмиду с сегментом vir и другую плазмиду с Т-ДНК,

несущей встроенный ген, эти бактерии могут трансформировать клетки растений.

В целом идеальная векторная система на основе Ti-плазмиды должна: 1)

содержать все сигналы, необходимые для переноса и стабильной интеграции в

ядерную ДНК растений; систему для экспрессии чужеродных генов в растениях

(узнаваемый растительными полимеразами промотор), маркер, который необходим

для селекции трансформированных клеток; 2) не содержать онкогенов, то есть

генов, которые подавляют дифференцировку растительных клеток. Второй пункт

достигается с помощью транспозонного мутагенеза (транспозон -

последовательность ДНК, способная перемещаться по геному). В результате

введения транспозона в Т-ДНК можно выключить гены, которые приводят к

опухолеобразованию (iaaM, iaaH, ipt), что не отражается на механизме переноса

Т-ДНК. Обычно используют бактериальные транспозоны (Tn5, Tn7). При этом

снимается блок с процессов регенерации. При модификации Ti-плазмиды

необходимо предусмотреть также наличие уникальных сайтов рестрикции, в

которые будет клонирован чужеродный фрагмент ДНК. Такие уникальные сайты

рестрикции создаются включением в искусственные Ti-конструкции

последовательностей, которые содержат множественные сайты разрезания для

рестриктаз EcoR1, Hind III, BamH1 и др. В некоторых случаях в одном

множественном сайте имеется 18-20 сайтов, узнаваемых разными рестриктазами,

почему эти участки и называются полилинкерами.

Кроме того, при конструировании векторных молекул должно быть предусмотрено

наличие промоторов, работающих в растениях. Промотор (участок, к которому

присоединяются РНК-полимеразы) должен обладать набором свойств, а именно:

силой (активной экспрессией), возможностью регуляции, ткане- и

органспецифической экспрессией. Так, например, к регулируемым промоторам

относится промотор генов белков теплового шока (генов, активность которых

индуцируется при повышенной температуре), а тканеспецифичная экспрессия

характерна для генов, контролирующих синтез запасных белков, например зеина,

который обнаружен только в тканях семян злаков. Наиболее популярным является

промотор гена вируса мозаики цветной капусты (CAMV). Гены, подшитые к такому

промотору, активно экспрессируются во всех тканях.

Наконец, в векторе должны быть предусмотрены маркеры, с помощью которых

возможен отбор трансгенных растений. В литературе маркерные гены еще называют

репортерными. Их достаточно много. Например, luxA и luxB - это гены,

выделенные из ДНК светлячков. Они контролируют синтез люциферазы, которая

обеспечивает переход люцефиринов из окисленной формы в основную, что и

обеспечивает свечение. В последнее время пользуется популярностью другой

репортерный ген - pgfp, который контролирует синтез GFP-белка (green

fluorescent protein). Этот ген был выделен из ДНК медузы Acquorea victoria.

Трансгенные растения с этим геном светятся в ультрафиолете зеленым светом.

Традиционный способ трансформации растительных клеток с помощью Т-ДНК

заключается в нанесении агробактерий, содержащих Ti-плазмиду, на специально

поврежденный побег. Сейчас используют широкий арсенал методов для получения

трансгенных растений. Создан даже специальный прибор - "Shotgun", который

стреляет мельчайшими вольфрамовыми пульками, одетыми в молекулы ДНК,

осуществляя таким образом трансформацию растительных клеток.

2.7. ПРАКТИЧЕСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИНЖЕНЕРИИ РАСТЕНИЙ С

ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ Ti-ПЛАЗМИД

Еще несколько лет назад ученые задавали вопрос, можно ли создать сорта,

сбалансированные по составу аминокислот, устойчивые к холоду, засухе, не

поражаемые вредителями. Сегодня можно с уверенностью утверждать, что такие

трансгенные растения уже вышли в поле. По литературным данным, к 1997 году в

30 странах мира проведено более 3 тыс. полевых испытаний. В этих

экспериментах использовали трансгенные растения 40 различных видов,

относящихся к разным семействам, включая злаки. После успешных экспериментов

появились опасения о возможном вреде генетической инженерии для природы и

человечества. Однако уже более чем за четверть века своего существования

генетическая инженерия не принесла ущерба ни природе, ни человеку. Главное, в

любых экспериментах по генной инженерии следует соблюдать разработанные

правила.

Наиболее остро стоит вопрос о получении растений, устойчивых к вредителям

сельского хозяйства, так как болезни растений стали основным лимитирующим

фактором получения урожая. В арсенале генной инженерии растений есть много

приемов, позволяющих получить трансгенные растения, устойчивые к насекомым.

Традиционно используют ген bt, продуктом которого является бактериальный

токсин Bacillus thuringiensis. Эта тюрингская бактерия продуцирует крупный

белок (протоксин), контролируемый геном bt, который, попадая в кишечник

личинок насекомых, разрушается под действием ферментов, а его фрагмент

(эндотоксин) приводит к их гибели. На приведена схема конструирования вектора

и получения трансгенных растений хлопка, которые приобретают признак

устойчивости к насекомым. В настоящее время уже синтезирован искусственный

ген bt, конструкция с которым более эффективна, а сами трансгенные растения

обладают широким спектром устойчивости к насекомым. Трансгенные растения

картофеля, хлопка, кукурузы с геном bt уже производятся фирмами "Monsanto",

"Ciba Seeds" и продаются на рынках мира, хотя дискуссии об их использовании

еще не закончены.

Известно, что растения, так же как и животные, способны вырабатывать

иммунитет. Этим замечательным свойством обладают только устойчивые растения,

у которых при атаке патогенов сильно меняется метаболизм. Например, у

устойчивых растений накапливаются такие химические соединения, как перекись

водорода (Н2О2), салициловая кислота (SA), фитоалексины (соединения,

выполняющие защитную функцию в растении). Повышенное содержание этих

соединений способствует противостоянию растения в борьбе с патогенами. Вот

один из примеров, доказывающий роль салициловой кислоты в иммунном ответе

растений. Трансгенные растения табака, которые содержат бактериальный ген,

контролирующий синтез салицилат гидролазы (этот фермент разрушает SA), были

неспособны к иммунному ответу. Поэтому изменение генно-инженерным путем

уровня салициловой кислоты или выработки в растениях в ответ на патоген H2O2

может быть перспективным для создания устойчивых трансгенных растений.

В последние годы ученые используют новый подход для получения трансгенных

растений с "antisense RNA" (перевернутой или антисмысловой РНК), который

позволяет управлять работой интересуемого гена. В этом случае при

конструировании вектора копию ДНК (к-ДНК) встраиваемого гена переворачивают

на 180?. В результате в трансгенном растении образуется нормальная молекула

мРНК и перевернутая, которая в силу комплементарности нормальной мРНК

образует с ней комплекс и закодированный белок не синтезируется. Такой подход

использован для получения трансгенных растений томатов с улучшенным качеством

плодов. Вектор включал к-ДНК гена PG, контролирующего синтез

полигалактуроназы (polygalacturonase) - фермента, участвующего в разрушении

пектина, основного компонента межклеточного пространства растительных тканей.

Продукт гена PG синтезируется в период созревания плодов томатов, а

увеличение его количества приводит к тому, что томаты становятся более

мягкими, что значительно сокращает срок их хранения. Отключение этого гена в

трансгенах позволило получить растения томатов с новыми свойствами плодов,

Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6