Следует отметить, что добавление секреторных фосфолипаз во внеклеточную среду приводит к активному высвобождению арахидоновой кислоты и синтезу простаноидов активированными клетками, но практически не влияет на гидролиз фосфолипидов мембран покоящихся клеток.

Помимо роли фермента, ответственного за наличие арахидоновой кислоты, секреторные фосфолипазы могут выступать в роли физиологически активных веществ. Так, в тучных клетках специфические ингибиторы секреторных фосфолипаз уменьшали стимулированную фактором роста нервов экспрессию циклооксигеназы-2. При этом каталитически неактивные мутанты белка фосфолипазы также были способны вызывать экспрессию циклооксигеназы-2, т.е. этот эффект не зависит от ферментативных свойств фосфолипазы. Механизм этого процесса не ясен. Возможно, вовлекаются функции секреторной ФЛА2 как лиганда специфических рецепторов.

Действительно, в 1995 г. было показано, что существуют специфические белки, которые связываются с фосфолипазой типа IB (константа диссоциации образовавшегося комплекса 1 нмоль/л) и проявляют различные биологические эффекты. За последующие 10 лет обнаружено ещё много белков, растворимых и мембраносвязанных, которые способны связывать секреторную фосфолипазу. Однако свойства «классического» рецептора, который при связывании лиганда активирует систему внутриклеточной передачи сигнала, проявляет только один из этих белков. Это белок M-типа, или sPLA2R. Ген данного белка локализован во второй хромосоме; белковая последовательность имеет 75 % гомологии среди ряда видов млекопитающих; ген имеет 1 копию и ничем не похож на другие гены. Белок имеет молекулярную массу 180-200 кДа, значительная его часть расположена во внеклеточной области, в цитозоле находится последовательность из 40 аминокислотных остатков. Белок без этого цитозольного участка встречается в растворимой форме и показана его роль как ингибитора эффектов секреторных фосфолипаз. У человека белок экспрессирован в поджелудочной железе, лёгких и почках. Показана важная роль активации этого рецептора в развитии эндотоксического шока.

На рисунке представлена схема участия рецептора секреторной фосфолипазы в реализации биологической роли фермента на уровне клеток.

На схеме показано, как активные формы фосфолипазы sPLA2-IB или sPLA2-X проявляют свою ферментативную активность, что приводит к появлению липидных медиаторов, а также являются высокоаффинными лигандами для рецептора, локализованного в плазматической мембране. Взаимодействие фосфолипазы с рецептором мембраны приводит к индукции митогенактивированных протеинкиназ (MAPK) и соответствующего пути внутриклеточного проведения сигнала, что стимулирует различные ответы клеток: пролиферацию и миграцию клеток, синтез ими физиологически активных веществ. При потере контакта с мембраной рецептор сохраняет возможность связывать фосфолипазу, что позволяет регулировать активность последней как фермента и как лиганда.

Таким образом, секреторные фосфолипазы играют существенную роль в развитии и распространении воспалительных процессов в организме. Экспрессия секреторных фосфолипаз значительно увеличивается при разнообразных воспалительных заболеваниях. По этой причине разрабатывают селективные ингибиторы ферментативной активности белков этого семейства как потенциально новый класс противовоспалительных веществ. Для поиска ингибиторов секреторных фосфолипаз перспективно применение методов компьютерного моделирования, так как эти низкомолекулярные белки (их молекулярная масса около 14 кДа) получены в кристаллическом состоянии, известны их трёхмерные структуры. Есть основания полагать, что в ближайшие 5-10 лет на основании результатов этих исследований будут созданы новые терапевтические технологии и новые лекарственные средства.

2.2.3 Кальцийнезависимая ФЛА2

Классическая кальцийнезависимая ФЛА2 (iPLA2-VIA) существует в олигомерной форме и имеет несколько сплайс-вариантов, из которых, по крайней мере, два (VIA-1 и VIA-2) обладают ферментативной активностью. Белок iPLA2-VIA-1 имеет молекулярную массу 85 кДа; содержит 8 анкириновых повторов в области N-конца, каталитический домен с характерной аминокислотной последовательностью GXSXG, где S - серин-465 действует как центр катализа. Имеется также ATP-связывающая последовательность GXGXXG. Около С-конца (в области аминокислотных остатков 694-705) существует связывающая область для калмодулина. Образование комплекса белка iPLA2-VIA с активированным калмодулином (т. е. в присутствии ионов Ca2+) приводит к инактивации данной фосфолипазы. Хотя обе сплайс-формы VIA-1 и VIA-2 имеют ATP- связывающие последовательности, показано, что только белкок iPLA2-VIA-2, но не iPLA2-VIA-1, активируется в несколько раз в присутствии ATP.

Анкириновые повторы встречаются у нескольких сотен белков, таких как факторы транскрипции, регуляторы клеточного цикла. Считается, что данный мотив участвует в белок- белковых взаимодействиях. Предполагают, что в клетках белок iPLA2-VIA присутствует в виде тетрамера и, возможно, анкириновые мотивы участвуют в олигомеризации белка. Фосфолипаза iPLA2-VIA не специфична к природе жирных кислот в положении sn-2 и заместителю в положении sn-3 фосфолипида; полностью активна в отсутствие кальция и осуществляет межфазный катализ. Фермент также проявляет лизофосфолипазную активность по положению sn-1, трансацилазную активность и активность, характерную для белка PAF-AH.

Белок iPLA2-VIB содержит липазный мотив GVSTG, где серин-483 находится в каталитическом центре; ATP-связывающий мотив; мотив сигнала локализации в пероксисомах на С- конце молекулы. С-концы молекул, включая ATP-связывающий повтор и каталитический участок, белков iPLA2-VIB и iPLA2-VIA сходны. Отличия наблюдаются в N-конце белка, где у белка iPLA2- VIB нет анкириновых мотивов, много сериновых и треониновых остатков, часть которых может фосфорилироваться протеинкиназами А и С. Также имеются пять участков Ser-Pro, которые являются мишенями для пролиновых киназ. Одна из этих последовательностей (PTSP, остатки 269-272) является сайтом фосфорилирования митогенактивированными протеинкиназами. От ионов кальция активность данной изоформы не зависит. Наличие различных участков фосфорилирования у белков группы iPLA2-VI указывает, что роль белков iPLA2-VIA и iPLA2-VIB в клетках может отличаться. Обе кальцийнезависимые фосфолипазы (iPLA2-VIA и iPLA2-VIB) являются мембраносвязанными белками.

2.3 Субстратная специфичность

Катализ код действием ФЛА2 характеризуется поверхностной, позиционной и стерической специфичностью фермента. Фосфолипаза катализирует реакцию на поверхности раздела липид/вода. С одной стороны, для большинства липолитичсскнх ферментов, включая и ФЛА2, активность фермента оказывается значительно выше при существовании субстратов в форме агрегатов (мицелл, смешанных мицелл, монослоев и бислоев), чем при действии на водорастворимые субстраты в мономолекулярной форме.

С другой стороны - ФЛА2 не действует на липидные молекулы в составе плотно упакованных и, следовательно, труднодоступных липидных агрегатов. Для создания поверхности раздела фаз в этих случаях обычно используют детергенты (тритон х-100, дезоксихолат натрия). Доказано, что для оптимального проявления поверхностной специфичности фермента необходимо наличие агрегированных субстратов с определенной длиной ацильной цепи.

С обнаружением стерической и позиционной специфичности ФЛА2, были сформулированы довольно строгие минимальные требования фермента к субстрату: в положении sn-2 глицеринового остатка липид должен содержать сложноэфирную группу, а в положении sn-з - фосфатную. Позднее было показано, что остаток фосфорной кислоты может быть замещен сульфониевым: сульфолипид оказался хорошим субстратом ФЛА2, соответствующие фосфолппиды, где связь С-О-Р замещена на связь С-Р, также гидролизуются ферментом, но в меньшей степени. Поэтому минимальные требования фермента к субстрату в настоящее время сводят к тому, чтобы глицерофосфолипид обладал природной L-конфигурацией и имел сложноэфирную связь в sn-2-положении глицерина, а также содержал на расстоянии пяти-шести атомов от карбоксильного углерода группу с сильными анионными свойствами. Считается, что фосфатная группа должна иметь одну свободную кислотную функцию.

В фосфолипиде с двумя чувствительными сложиоэфирными связями - дифосфатидилглицерине(кардиолипинс) - гидролизоваться могут обе. Было установлено, что в-лецитины (1, 3-диацил-sn-глпцеро-2-фосфохолиньг) гидролизуются ФЛА2 из яда змеи Crotalus adaincniteus, хотя и со сравнительно низкой скоростью. ФЛА2 не гидролизует амидную связь сфинголипидов. Тиоловые аналоги фосфатидилхолинов являются хорошими субстратами, что позволяет следить за процессом гидролиза спектрофотометрически. Де Хаас и др. установили, что отрицательный заряд на фосфатной группе не является абсолютным требованием к субстрату.

Благодаря стерической и позиционной специфичности, ФЛА2 - ценный инструмент в химии и биохимии липидов. Их используют для установления позиционного распределения жирных кислот при анализе фосфоглицеридов, для разделения рацемических смесей липидов, а также в синтезе липидов для получения фосфоглицеридов со смешанным составом жирных кислот.

Субстратная специфичность клеточных ФЛА2 до сих пор еще полностью не очерчена, однако накоплены данные относительно строения субстратов для ФЛА2 клеток крови и иммунной системы, в частности, доказана специфичность этих ферментов к фосфатидилхолинам, содержащим в sn-2-положении глицерина арахидонат.

2.4 Ингибиторы ФЛА2

2.4.1 Неконкурентные ингибиторы

Снижение каталитической активности ФЛА2 может происходить вследствие нарушения равновесия на одной или на нескольких стадиях ферментативной реакции, поэтому известные ингибиторы этого фермента можно условно разделить следующим образом.

а) Связывание ингибитором фермента (Е) может сдвигать равновесие Е-Е* влево и понижать концентрацию каталитически активного Е*. Это происходит при добавлении к везикулам субстрата везикул негидролизуемого аналога субстрата, с которым фермент связывается, но не может быстро десорбироваться. Необходимость наличия ионов кальция при связывании ФЛА2 с межфазной поверхностью дает основания относить к числу ингибиторов хелатирующие агенты, например EDTA.

б) Липофилъные соединения изменяют фазовые свойства субстратов и уменьшают плотность заряда на межфазной поверхности, сдвигая равновесие Е-Е* влево. Было показано, что такие изменения вызывают органические растворители, детергенты, спирты, а также катионные амфифилы, фенотиазины и местные анестетики различной химической природы. Другие ингибиторы - жирные кислоты, мепакрин, аристолоховая кислота - также влияют на стадию связывания-десорбции Е-Е*, не затрагивая каталитического действия фермента на межфазной поверхности.

в) Некоторые типы неспецифического ингибирования. При определенных условиях скорость гидролиза под действием ФЛА2 фосфолипидов, подвергшихся перекисному окислению, значительно увеличивается. Поэтому антиоксиданты считаются потенциально способными понижать активность фермента. Белки типа липокортина и калпактина солюбилизируют фосфолипиды межфазной поверхности, тем самым снижая активность ФЛА2. Водорастворимые анионы, такие как гепарин, ингибируют связывание ФЛА2 с межфазной поверхностью путем блокирования анионного участка связывания фермента.

г) Ковалентные модификации аминокислотных остатков ФЛА2. 1-Бромоктан-2- он и n-бромфенацилбромид ковалентно связываются с His-48 в каталитическом центре фермента и полностью угнетают каталитическую активность; скорость такой модификации значительно снижается, когда фермент уже связан с межфазной поверхностью. Диальдегиды, подобные госсиполу, модифицируют аминогруппы остатков лизина ФЛА2, ответственные за ее межфазное связывание; скорость модификации увеличивается в случае уже связанного с межфазной поверхностью фермента. Подобным образом действуют нестероидный терпеноид маноалид, выделенный из морской губки и его синтетический аналог маноалог.

д) Другие соединения. Предположительно, многие другие соединения, в том числе некоторые лекарства, подавляют активность ФЛА2 in vivo, однако, механизм их ингибиторного действия еще не выяснен. Среди таких веществ - биофлавоноиды и ретиноиды, гидроксиэйкозатетраеновые кислоты, фенофетол (агонист [в-адренэргических рецепторов), габексатмезилат, нисерголин, папаверин, циннаризин и амперон.

2.4.2 Конкурентные ингибиторы

Конкурентные ингибиторы ФЛА2 - это аналоги субстратов, продуктов реакции или комплекса переходного состояния. Они конкурируют с субстратом за связывание с активным центром молекулы Е*, эффективно понижая концентрацию комплекса ES*. Этот механизм ингибирования был экспериментально подтвержден при изучении катализа фосфолипидов под действием ФЛА2 по типу "scooting".

Общепринятая стратегия создания ингибиторов состоит в замене чувствительной к ФЛА2 сложноэфирной связи на негидролизуемую группу. При этом ингибитор должен оставаться близким структурным аналогом субстрата и не вызывать изменений в липидных мембранах. В настоящий момент не представляется возможным сопоставить имеющиеся данные о конкурентных ингибиторах, поскольку еще не выработано единой теории и количественного описания липолиза на границе раздела фаз липид/вода.

Страницы: 1, 2, 3, 4