Влияние аминоацильных аналогов фосфолипидов на ферментативную активность ФЛА2, исследовалось, в основном, в модельных экспериментах со смешанными мицеллами при соблюдении следующих условий:

1)общая концентрация липидов (ингибитора и субстрата) [I] + [S] должна быть постоянной для расчета мольной доли ингибитора, б = [I]/([I] + [S]);

2)молекулы субстрата и ингибитора должны занимать одинаковую площадь на межфазной поверхности;

3)межфазная поверхность мицелл должна быть достаточно большой, чтобы фермент находился только в связанной форме.

Для оценки воздействия ингибитора на активность ФЛА2 была использована условная величина ингибиторной силы (Z), которая является мерой соотношения констант межфазной диссоциации для субстрата и ингибитора и определяется выражением:

Rv = I + бZ,

где Rv - отношение скорости реакции при К?Кm к скорости реакции при Кi = Кm, б - мольная доля ингибитора в мицелле.

Изучали также ингибиторное действие (R)-1- алкил-2-ациламино-1,2-дидезоксиглицеро-З-фосфохолиновых аналогов на панкреатические фосфолипазы млекопитающих. Среди ингибиторов с насыщенными жирнокислотными цепями наибольшую активность имели аналоги с С10-ацильными цепями. Поведение ненасыщенных аналогов было более сложным как в цвиттерионных, так и в анионных ингибиторах, увеличение числа цис-двойных связей при их определенном расположении в ацильной цепи приводило к возрастанию параметра Z [80].

В ходе исследований стиоамидными аналогами субстратов выяснилось, что тиоамидный аналог фосфатидилэтаноламина с lС50=4.5 * 10-7 М является самым сильным из известных ингибиторов ФЛА2.

Исследования, проведенные с аминоацильными ингибиторами, выявили некоторые аспекты взаимодействия фермент/липид:

1) Введение амидного остатка в sn-2-положение фосфолипида значительно увеличивает его связывание с каталитическим центром ФЛА2: более нуклеофильный атом кислорода амидной группы способен сильнее взаимодействовать с электрофилом этого центра (предположительно, Са2+). Амидная группа предоставляет лучшие возможности и для водородного связывания.

2) б-Метиленовая группа ацильного остатка sn-2-положении фосфолипида отвечает за связывание фосфолипида с каталитическим центром фермента.

3) Увеличение гидрофобности функциональной группы sn-1-положении фосфолипида повышает сродство между ферментом и субстратом.

4) Фосфатидилэтаноламииы оказались более сильными ингибиторами, чем фосфатидилхолины.

Подход к синтезу оптически активных 1-ацил- 2-ациламино-2-дезоксиглицерофосфохолинов основывается на сохранении хиральности исходного соединения (L-серина) на протяжении всего синтеза. Выбранная последовательность введения заместителей предполагает использование минимального числа защитных групп. Также разработан стереоспецифический метод синтеза 1-алкил-2-ациламино-2-дезоксиглицерофосфохолинов исходя из L-серина. Введение алифатической алкильной группы осуществляют взаимодействием метансульфоната жирной кислоты с оксазолинзащищенным дезоксиглицеридом. Рацемические длинноцепочечные ациламиноаналоги фосфолипидов предложено получать исходя из 2-аминопропанола. Описан синтез оптически активного тиоамидного аналога фосфатидилхолина.

Фтаркетоновые аналоги. Ранее установлено, что аналоги субстратов, содержащие поляризованные кетоновые группы, включая фторкетоновые и 1,2-дикетоновые, ингибируют гидролитические ферменты. Наилучшим ингибитором оказался замещенный фосфоэтаноламин с единственным ацильным остатком, несмотря на то, что фермент предпочитает субстраты с двумя ацильными остатками

Так как дифторкетоновая группа легко гидратируется в водном растворе, ингибиторы напоминают по структуре тетраэдрический интермедиат, который образуется во время липолиза.

Среди фторкетоновых аналогов были найдены селективные ингибиторы внутриклеточных цитозольных ФЛА2. Такими ингибиторами оказались электрофильные кетоновые аналоги арахидоновой кислоты.

Самым мощным ингибитором оказался, б-трифторметилкетон арахидоновой кислоты. Методами l9F- и 13С-ЯМР-спектроскопии анализировали строение комплекса этого вещества с ФЛА2. Результаты подтвердили гипотезу о том, что при связывании с активным центром фермента образует полукеталь с остатком серина или треонина молекулы белка, благодаря способности б-фторкетонов легко гидратироваться в водных растворах.

Фосфатные аналоги. Для изучения природы ингибирования ФЛА2 из различных источников и влияния заместителей на ингибиторную способность было синтезировано более 100 sn-2-фосфатных аналогов фосфатидилхолинов. Соединения данного класса ингибировали только фермент, уже связанный с межфазной поверхностью и не оказывали влияния на десорбцию фермента. Фосфатные ингибиторы связываются с активным центром фермента через ион кальция координационной связью Е-Са....О=Р, конкурируя с субстратами. Это взаимодействие модулируется заместителями молекулы ингибитора. Замещение в этом комплексе атома О на S, NН2, группы 0=Р на О=С-О, присутствие отрицательно заряженной фосфатной группы значительно понижало сродство к ферменту. Ингибиторная способность фосфоэфиров находилась в строгой зависимости от стереохимических и структурных особенностей: хиральности sn-2-положения, длины алкильной цепи в sn-положении и присутствия гидрофобного заместителя в sn -3-положении глицерина. Сульфонатные, амидные, оксимсодер жащие, дианионные фосфомоноэфирные аналоги не проявляли ингибиторных свойств.

Алкильные фосфотидилхолины. Для фармакологического использования, по-видимому, наиболее перспективными являются вещества, способные ингибировать ФЛА2 без нарушения структурной организации мембраны. Особый интерес в этом плане представляют липиды с простой эфирной связью. В молекулах липидов данного класса гидрофобные заместители присоединены к гидрофильному остатку за счет негидролизуемой ФЛА2 простой эфирной связи. Вместе с тем, по своему поведению в составе мембран липиды с простой эфирной связью практически не отличаются от своих диацильных аналогов. Изучали влияние длинноцепочечных фосфатидилхолинов с простой эфирной связью на разрушение мембран под действием ФЛА2 методом спектроскопии ''Р-ЯМР и оценивали возможность применения липидов при местных воспалительных реакциях.

Для исследуемых ингибиторов были получены практически одинаковые результаты: введение соединений в состав липидного бислоя из яичного фосфатидилхолина в мольном соотношении 1: 1 приводило к настолько эффективной стабилизации мембран, что не наблюдалось никаких структурных перестроек под действием этого фермента.

Среди фосфолипидов данного класса были найдены ингибиторы цитозольных ФЛА2:, обладающие противовоспалительными и антиаллергическими свойствами.

2.5 Значение для организма при нарушении активности

В патогенезе повреждения клетки важное значение имеет чрезмерная активация ФЛА2. Освободившиеся под действием фосфолипазы, ненасыщенные жирные кислоты (арахидоновая, пентаноевая и др.) расходуются на образование физиологически активных соединений -- простагландинов и лейкотриенов. Оставшаяся часть молекулы фосфолипида (лизофосфолипид) имеет лишь один жирнокислотный "хвост", вследствие чего обладает способностью к мицеллообразованию и является очень сильным детергентом. С детергентным действием лизофосфолипидов и связано повреждение клеточных мембран в условиях чрезмерной активации ФЛА2.

Фармакологические и токсические свойства фосфолипазы обусловлены ее биохимической активностью. С помощью своего токсического лизолецитина, она расщепляет кровяные и тканевые структуры, повреждая их клеточные мембраны и органеллы. Фосфолипаза снижает свертывание крови, разрушая способствующие свертыванию компоненты, в структуре которых имеются фосфолипиды. Она повреждает мембраны митохондрий, а последние являются важным органоидом клетки, носителями сложных ферментных систем. Они участвуют в обмене веществ и окислительно-восстановительных процессах. Повреждение фосфолипидной структуры нервных волокон, вероятно, обусловлено фосфолипазой, которая блокирует проводимость между нервной и мышечной тканью.

Введение фосфолипазы под кожу вызывает местное воспаление, а внутривенное сопровождается снижением кровяного давления у подопытных животных, отеком легких, кровоизлияниями в альвеолах. У переживших несколько часов животных, в моче обнаруживается гемоглобин разрушенных эритроцитов. Кроме того, установлено, что фосфолипаза пчелиного яда, введенная под кожу, усиливает развитие модельных воспалительных процессов различной этиологии.

Высказывается предположение, что своим снижающим поверхностное натяжение действием мелиттин подготавливает фосфолипиды к энзимной активности фосфолипазы. Из всех составных частей пчелиного яда фосфолипаза является наиболее сильным антигенным и аллергенным раздражителем. В крови иммунных к пчелиному яду пчеловодов имеются антитела с высоким титром против яда. Сверхчувствительные к пчелиному яду пациенты при лабораторных исследованиях на аллергичность остро реагировали на фосфолипазу.

Усиливающие воспалительные процессы токсические и аллергические свойства фосфолипазы характеризуют ее как вредную для организма человека составную часть пчелиного яда.

Активация ФЛА2 зависит от кальция. Она происходит при стимуляции клеток надпочечников, что приводит к ускорению кругооборота арахидонилфосфатидилинозитола. Этот эффект вызывается также кальциевым ионофором и может отражать повышение внутриклеточного уровня кальция и вторичной стимуляцией ФЛА2 в качестве ранней реакции, сопутствующей рецепторному взаимодействию. Известно, что действие на стероидогенез в надпочечниках зависит от кальция, а не только от образования цАМФ. По крайней мере, часть потребностей в кальции может быть связана с опосредуемым ФЛA2 кругооборотом мембранных фосфолипидов при активации коры надпочечников.

Механизм, включающий активацию фосфолипазы, может отражать общее свойство гормонрегулируемых секреторных клеток, при гормональной стимуляции специфических клеток мишеней меняются и другие этапы метаболизма фосфолипидов. Так, в клетках гранулемы яичника, где ЛГ увеличивает продукцию простагландинов, гормон не повышает образование арахидоновой кислоты, а действует на более поздних этапах, увеличивая активность простагландинсинтетазы. Этот эффект ЛГ на синтез простагландинов в граафовом фолликуле (пузырчатый яичниковый фолликул), по-видимому, не опосредует стероидогенного действия гонадотропина, но играет важную роль в развитии овуляции.

2.6 Использование ФЛА2 в медицине

Секреторную ФЛА2 рассматривают как один из патогенетических факторов формирования ряда заболеваний: ревматоидного артрита, атеросклероза. В последние годы появились сведения о причастности этого фермента к патологии легких. Особый интерес представляет патогенетическая цепь "сФЛА2 -острый респираторный дистресс синдром (ОРДС) - сурфактант легких".

Острый респираторный дистресс синдром взрослых возникает в результате как прямых воздействий на легкие (аспирация, ингаляция токсических веществ,100% кислород, недостаточно квалифицированное проведение ИВЛ), так и непрямых (сепсис, шок любой этиологии, политравма, кровопотеря). Несмотря на годы интенсивных исследований, механизм развития ОРДС остается до конца не ясен, а смертность от него высокой (~50%). Считают, что в основе происхождения этого состояния легких лежит снижение продукции и активности сурфактанта.

Сурфактант легких - липогликопротеиновый комплекс, который синтезируется альвеолоцитами II типа. Он состоит на 80-90% из фосфолипидов, 5-10% нейтральных липидов и 5-10% белков. Кроме поверхностно-активных свойств, необходимых для нормального дыхания, он обладает противовоспалительным и иммунорегуляторным действием. Нарушение его целостности приводит к увеличению сил поверхностного натяжения не только в альвеолах, но и в бронхиолах и мелких бронхах.

Субстратная специфичность цитозольной ФЛА2 к арахидоноил-содержащим субстратам предполагает, что именно эта изоформа играет основную роль в патогенезе астмы. Известно, что лейкотриены В4, С4, D4, E4 - основная группа медиаторов, вовлеченная в комплексный воспалительный процесс и приводящая к клиническим проявлениям астмы. Действие лейкотриенов заключается в сокращении гладкой бронхиальной мускулатуры, увеличении количества вырабатываемой слизи, стимулировании сосудистой проницаемости и образовании отека. Все эти признаки свойственны астме. Лейкотриены синтезируются в ответ на воздействие аллергена или неспецифической реакции, приводящей к активации цФЛА2.

Chilton F. H. изучали присутствие продуктов фосфолипазной активности в бронхоальвеолярной лаважной жидкости больных астмой спустя 5-30 мин, 6, 20 ч. после антигенной провокации. Концентрация лизопродуктов была в 7 раз выше по сравнению с контрольной группой. Отсюда было сделано предположение о том, что гидролиз фосфолипидов сурфактанта приводит к генерации цитотоксичного лизофосфатидилхолина, который может оказывать прямое детергентное действие на мембрану и влиять на активность мембранных каналов и белков. Кроме того, трансформируясь в фактор активации тромбоцитов, он вызывает нарушение проницаемости альвеолярно-капиллярного барьера, бронхоспазм, агрегацию тромбоцитов.

Предполагается также участие цФЛА2 в возникновении и развитии легочного фиброза - малопонятного, на сегодняшний день, интерстициального поражения паренхимы легких. Патогенез этого состояния включает чрезмерную продукцию провоспалительных медиаторов, воспаление альвеол, пролиферацию фибробластов и накопление коллагена. Классической экспериментальной моделью этого состояния является фиброз легких, вызванный внутритрахеальным или внутрибрюшинным введением блеомицина.

Велика роль фосфолипазы в развитии некоторых форм панкреатита.

При недостаточности большого сосочка двенадцатиперстной кишки и повышенном давлении в двенадцатитперстной кишке возможен рефлюкс желчи или дуоденального содержимого в протоки поджелудочной железы. Желчь, попадая в протоки поджелудочной железы, может подвергаться воздействию панкреатической фосфолипазы, уже активированной трипсином, в результате чего образуется лизолецитин, который, проникая в интерстициальное пространство поджелудочной железы, вызывает глубокие повреждения в клетках.

Также доктором Heidi May была доказана, что липопротеин-ассоциированной ФЛА2 предсказывает риск коронарной смерти.

Полученные в последние годы сведения о причастности цитозольной и секреторной ФЛА2 к формированию патологии легких открывают перспективу поиска новых подходов к лечению таких заболеваний. Однако прежде необходимо четко определить место этих ферментов в патогенетической цепи молекулярных событий. И здесь важное значение может принадлежать "синдромальному " подходу. К примеру, еще нет сведений о состоянии ФЛА2 при гипертермии и гипоксии, при активации клеток продуцентов. Между тем, большинству заболеваний легких присущи эти состояния, которые во многом определяют клиническую картину, течение и исход патологического процесса.

2.7 Биологическая роль ФЛА2

К настоящему времени достаточно полно охарактеризованы и изучены секретируемые ФЛА2 ядов и панкреатических желез млекопитающих. Напротив, относительно низкие концентрации in vivo внутриклеточных и непанкреатических внешнеклеточных ФЛА2, серьезно осложняют исследования этого класса ферментов.

Установлено, что мембраносвязанные ФЛА2 играют важную роль в регуляторных процессах клеточного метаболизма. Известно несколько путей регуляции этих ферментов, однако общий механизм очень сложен и до конца не изучен. ФЛА2 участвует в передаче через мембраны химических сигналов в ответ на внешнее воздействие. Фермент эффективно гидролизует фосфолипиды, имеющие в своем составе пероксиды жирных кислот, восстанавливая структурно-функциональные свойства клеточных мембран. По-видимому, изменение молекулярной конформации окисленных липидов облегчает доступ фермента к sn-2-сложноэфирной связи.

На сегодняшний день установлено, что фосфолипазы А2 играют значительную роль в развитии воспалительного процесса. Вклад фермента заключается в запуске синтеза липидных регуляторов этой реакции - одной из групп так называемых химических медиаторов воспаления. Они образуются, активируются или мобилизуются в воспалительном очаге и их соотношением определяется характер течения патологического процесса. Медиаторы воспаления липидной природы представлены жирными кислотами и их производными (простагландинами, лейкотриенами, тромбоксанами), а также фосфолипидным фактором активации тромбоцитов (ФАТ). Полагают, что в воспалительном процессе участвуют внутриклеточные цитозольные ФЛА2, высвобождающие полиеновые кислоты из sn-2-положения глицеринового остатка мембранных фосфолипидов. Полиеновые жирные кислоты, включая и арахидоновую, обладают собственной биологической активностью, в т.ч. усиливают сосудистую проницаемость, вызывают агрегацию тромбоцитов, оказывают вазоактивное действие.

Другие продукты фосфолипазной реакции гидролиза - лизофосфолипиды, обладающие ярко выраженной цитотоксичностью и детергентными свойствами. Эти соединения обнаруживают при таких заболеваниях, как холецистит, инфаркт миокарда, катаракта, псориаз и др. Если жирная кислота высвобождается из фосфатидилхолина 1-О-алкилыюго типа, образующийся лизофосфолипид служит предшественником ФАТ - медиатора воспаления, аллергической реакции, септического шока и астматического состояния. Это соединение в настоящее время интенсивно изучается, агонистам и антагонистам ФАТ посвящено большое число публикаций.

Важное значение, которое имеет мембраносвязанная ФЛА2 в клеточной регуляции, а также ее повышенный уровень при ряде патологических процессов, приводят к необходимости регулирования активности этого фермента. Поэтому поиск новых классов липидных ингибиторов и разработка удобных методов их синтеза представляют в настоящее время практический интерес.

Список литературы

1. Брагина Н.А., Чупин В.В.,Булгаков В.Г. Липидные ингибиторы фосфолипазы А2, М., 1999, с. 83-96

2. Брокерхоф X., Дженсен Р., Липолитические ферменты,пер. с англ., M., 1978, с. 242-356

Страницы: 1, 2, 3, 4