Для качественной прививки фазы к силикагелю важна подготовка его поверхности перед прививкой. Поверхность должна быть полностью гидроксилирована и не содержать сорбированной воды. Если гидроксилирование поверхности проведено не полностью (например, силикагель пересушен выше 180-200 °С) это приводит к тому, что образовавшиеся силоксановые группы не вступают в реакцию прививки, и количество привитой фазы уменьшается. С другой стороны, при последующем использовании такого сорбента его свойства в процессе эксплуатации в водных средах будут меняться, так как возможен гидролиз силоксановых групп с образованием новых активных силанольных групп.

Гидроксилирование проводят кипячением силикагеля в воде в присутствии кислот в течение нескольких часов и затем сушат при температуре до 150 °С. Сушка должна обеспечить удаление физически сорбированной воды, так как она приводит к бесполезному расходу прививаемого хлорсилана, загрязнению сорбента побочными продуктами реакции и изменению выбранного мольного соотношения хлорсилана и силанольных групп.

Следует ли предпочесть сферические частицы матрицы частицам неправильной формы? Однозначного ответа нет. Но большинство исследователей предпочитают частицы правильной сферической формы, которые должны давать более плотно и равномерно упакованный слой сорбента, снижать сопротивление потоку, меньше разрушаться в процессе набивки и работы колонок и т.п. Пока никто еще убедительно не продемонстрировал заметных преимуществ сферических частиц; однако следует отметить, что большинство вновь появляющихся сорбентов являются сферическими микрочастицами.

Остановимся теперь на выборе прививаемого агента. Если вначале были испробованы многие классы прививаемых агентов, то в настоящее время практически остался один тип - хлop- или алкоксипроизводные алкилсиланов, дающие в провесе прививки довольно стойкую к гидролизу или расщепленную связь Si-О-Si-С. Метод прививки с образованием еще более прочной связи Si-С, заключающийся в замене в силанольных группах силикагеля гидроксильной группы на галоген (хлорирование силикагеля) и последующем взаимодействии галогена, например с бензиллитием используется только в исследовательской работе и мало пригоден для промышленного роизводства из-за взрывоопасности и нетехнологичности.

Алкилхлорсиланы, наиболее дешевые и доступные из прививаемых агентов, могут быть трех типов: алкилтрихлорсиланы, диалкилдихлорсиланы и триалкилхлорсиланы (вместо алкила может быть и арил). Из этих трех наиболее дешевый и доступный продукт - алкилтрихлорсиланы, которые и использовались практически во всех ранних работах и в производстве первых привито-фаэных сорбентов, появившихся на рынке. Однако для получения мономерного привитого слоя с применением этИХ силанов, имеющих три реакционноспособные группы, требуется очень высокий технический уровень работы, который относительно легко достигается в лаборатории, но трудно достижим на производстве. Если трихлорсиланы вступают в кон-акт с любым содержащим следы воды веществом (недосушенным силикагелем, воздухом, растворителем и др.), они немедленно отнимают воду, вступая в реакции.

Образующиеся при этом димеры, тримеры и продукты с еще большей степенью полимеризации реагируют с силанольнымв группами силикагеля, давая вместо мономерного привитой полимерный слой фазы. Этот полимерный слой, естественно, является неравномерным и большим по толщине, чем мономерный. Диффузия анализируемых молекул в таких более толстых пленках замедлена, и как правило, эффективность колонок с такими сорбентами более низкая. Другим недостатком является то, что те атомы хлора в молекуле, которые не прореагироваЛИ с силанольными группами из-за пространственных затруднений, могут в дальнейшем гидролизоваться в процессе работы вводными растворителями с образованием полярных силанольных групп. Последние могут взаимодействовать с анализируемыми веществами, имеющими полярные группы, изменяя времена удерживания.

Однако полимерные слои, особенно имеющие небольшую толщину и получаемые при малой степени полимеризации трихлорсиланов до и в процессе прививки, имеют и некоторые преимущества перед мономерным привитым слоем. В частности, если толщина слоя небольшая, то скорость диффузии анализируемых молекул уменьшается незначительно; в то же время такая полимерная молекула соединена с силикагелевой матрицей не одной, как мономерная, а многими связями. Поэтому разрыв одной связи, например, в результате гидролиза, приводит к отрыву и переходу в подвижную фазу мономерной молекулы, тогда как полимерная удерживается на месте другими связями и продолжает участвовать в разделении до разрыва всех удерживающих ее связей. Это важно, если по условиям анализа требуется использовать растворитель с рН<3 или >8, что ускоряет протекание гидролиза и отщепления привитой фазы.

Как видно из приведенной схемы димеризации алкилтрихлорсилана, если исходная молекула имеет три реакционно-способных хлора, то димер - четыре, соответственно тример будет иметь их 5, тетрамер - 6 и т.д. В этом случае, как мы видим, с увеличением молекулярной массы полимера число потенциальных центров прививки молекулы к силикагелю растет. Однако и пространственные затруднения при взаимодействии такой молекулы с силикагелевой матрицей также возрастают по мере роста ее молекулярной массы, поэтому по мере достижения некоторой молекулярной массы количество реально образующихся связей прививаемой фазы и силикагелевой матрицы доходит до максимума, а в дальнейшем начинает снижаться.

По приведенным выше схемам прививают такие распространенные агенты, как октилтрихлорсилан, октадецилтрихлорсилан и др.

По несколько другой схеме полимеризация осуществляется, если прививаемый агент - диалкилдихлорсилан (или алкиларилдихлорсилан, или диарилдихлорсилан).

Образующиеся при этой реакции димеры, тримеры и полимеры также могут реагировать с силанольными группами силикагеля, давая вместо привитого мономерного привитой полимерный слой фазы. Однако этот полимер отличается от того, который образуется при реакции с силикагелевой матрицей алкилтрихлорсиланов. Первое отличие состоит в том, что он получается линейным по цепи - Si-О-Si-О-Si-О-, поскольку исходный диалкилдихлорсилан и его димер, тример, тетрамер и т.д. являются бифункциональными и содержат по два активных атома хлора. Во-вторых, если прививка такого полимера к силикагелевой матрице происходит, она идет только в одной или в двух точках, т.е. отрыв при гидролизе такой привитой молекулы протекает более легко (достаточно разорваться одной или двум связям, и молекула полимера отрывается от матрицы и переходит в подвижную фазу). По указанной схеме прививают диметилдихлорсилан, дифенилдихлорсилан и др.

Наконец, если прививаемый агент является триалкилмонохлороиланом, он тоже может реагировать с водой, присутствующей в реакционной среде. Однако его реакционная способность значительно ниже, чем у ди- и трихлорсиланов.

Так как димер не имеет реакционноспособных атомов хлора то он не вступает ни в реакцию дальнейшей полимеризации, ни в реакцию прививки к силикагелевой матрице. Это очень важно, ибо в этом случае при прививке получается гарантировано только мономерный привитой слой неподвижной фазы. Образовавшийся димер в дальнейшем удаляется при отмывке непрореагировавшего реагента и побочных продуктов реакции. Последний способ прививки, как видно из обсуждения, дает наиболее упорядоченный по структуре и составу привитый слой. Поэтому хотя стоимость таких исходных реагентов несколько выше, а реакционная способность их ниже, что забавляет вести прививку в более жестких условиях и брать избыток прививаемого реагента, популярность таких сорбентов растет, и большая часть вновь появляющихся сорбентов, как отмечено в рекламных данных, получена с использованием этого метода прививки. По такой схеме прививают октилдиметилхлорсилан, октадецилдиметилхлорсилан, триметилхлорсилан и др.

Какие же алкильные группы можно химически привить указанными способами к поверхности силикагеля? Наиболее применимы длинные алкильные цепи, обычно C8 и C18, но в последнее время растет популярность привитых более коротких алкилов С4 и С3, особенно на силикагелях с широкими порами для анализа биологически важных больших молекул. Чаще всего применяют привитой октадецилсилан. Он наиболее сильно удерживает анализируемые вещества и позволяет работать с элюентами, содержащими мало воды. Это целесообразно, так как анализируемые вещества, как правило, лучше растворяются в метаноле или ацетонитриле, чем в воде. Кроме того, аномально высокая вязкость смесей метанола и воды существенно снижается при большом содержании метанола, что позволяет работать при сравнительно низком давлении на колонке с боль-Вой эффективностью за счет повышения скорости диффузии при снижении вязкости.

Арильные (ароматические) привитые группы получают аналогичным способом, однако их используют реже. Они позволяют получить селективность, отличающуюся от селективности на привитых алкильных группах.

По мере роста длины цепи прививаемой молекулы ее реакционная способность уменьшается за счет пространственных затруднений при взаимодействии с силанольными группами силикагеля. Если из 5 силанольных групп, приходящихся на 1 нм2 поверхности силикагеля, почти все удается заместить при прививке алкила C1, то при алкиле C18 в лучшем случае удается заместить половину из них. Оставшиеся на поверхности не вступившие в реакцию силанольные группы экранируются уже привитыми молекулами и не могут вступить в реакцию с новыми молекулами октадецилхлорсилана. Однако для молекул с меньшей молекулярной массой, будь то молекулы растворителя или анализируемых веществ, пространственная затрудненность может оказаться недостаточно большой, чтобы воспрепятствовать их взаимодействию. Это может существенно изменить вид хроматограммы, которая покажет аномально большое удерживание (иногда с заметным уширением пика) для таких анализируемых молекул.

Для того чтобы более полно устранить силанольные группы на поверхности, которые остались после прививки октадецилхлорсилана, проводят окончательное закрытие («энд кэппинг») их путем обработки силилируюшими агентами, имеющими малый размер молекул, обычно триметилхлорсиланом. Такие малые молекулы легко вступают в реакцию с частично экранированными силанольными группами. Аналогичную реакцию окончательного блокирования силанольных групп на поверхности силикагеля часто используют в тех случаях, когда прививку фазы проводят полимеризующимися три-и дихлорсиланами. Устранение силанольных групп с поверхности и их замена на триметилсилильные гидрофобные группы повышает также устойчивость силикагельной матрицы к воздействию воды, особенно при рН менее 3 и более 8.

Условия проведения «энд кэппинга», в том числе предварительная подготовка и обработка поверхности с целью перевода оставшихся непрореагировавших атомов хлора в гидроксильные или другие реакционноспособные группы, выбор растворителей, катализаторов, условий реакции, как правило, составляют «ноу хау» фирмы. Часто проведение «энд кэппинга» практически не меняет таких характеристик сорбента, как содержание углерода, удельная поверхность и др., однако характер взаимодействия с поверхностью такого сорбента для молекул, имеющих полярные группы, особенно обладающие кислотными или основными свойствами, изменяется очень резко.

Наряду с алкильными и арильными группами таким же путем, используя замещенные моно-, ди- и трихлорсиланы, можно к силикагелевой матрице привить и другие группы, наиболее распространенными из которых (в порядке уменьшения частоты применения) являются следующие: - Si - (СН2) 3-СN-алкилнитрильная группа; - Si - (СН2) зNН2-алкиламинная группа (возможна вторичная или третичная аминогруппа), слабый анионообменник; - Si - (СН2) з-СН (ОН) - СН2ОН - алкилдиольная группа; - Si-СН2-С6Н4-SO3H-сильный катионообменник, содержащий сульфогруппу (или сульфогруппы); - Si - [Alk4N]+OH- - сильный анионообменник, содержащий четвертичную аммониевую группу.

Если алкилнитрильную и алкиламинную группы прививают, как правило, за один прием, то прививка других групп более сложна и включает ряд последовательных реакций (две или три). Такие сорбенты, естественно, более сложны в производве, и воспроизводимость их характеристик ниже, тогда как стоимость значительно выше.

Алкилнитрильную, алкиламинную и алкилдиольную привитые фазы можно использовать в разных вариантах хроматографии. Прежде всего они могут быть применены для работы с неполярными растворителями типа гексан - изопропанол, где они проявляют свойства, близкие к свойствам силикагеля без привитой фазы. Однако их селективность отличается от селективности силикагеля, что позволяет подобрать наилучший сорбент для каждого анализа. Кроме того, их преимуществом перед силикагелем является более быстрое уравновешивание с растворителем, и это позволяет использовать их при работе с изменением состава растворителя в процессе анализа, т.е. с градиентом растворителя. Они также менее чувствительны к влиянию воды.

Алкилнитрильную фазу используют и в обращенно-фазной хроматографии, селективность при этом получается иная, чем на силикагелях с алкильной группой. Такой же эффект наблюдается при применении алкиламинной группы. Кроме того, она проявляет слабые анионообменные свойства, что часто используют при анализе биологически активных веществ, например олигодигонуклеотидов с градиентами по рН и силе буферного раствора. Алкилдиольную группу, кроме нормально-фазной хрома-графии, применяют как фазу, позволяющую работать с белками в режиме эксклюзионной хроматографии, которая не сорбирует необратимо и не денатурирует их, сохраняя биологическую активность белков.

Сильные катионо- и анионообменники находят применение анализе биологических жидкостей для определения ряда лекарственных препаратов, биогенных аминов, их метаболитов и др. Разработан метод ион-парной хроматографии, в котором используют динамические слои катионо- или анионоактивных агентов, обладающие свойствами ионообменников и в то же время обращенно-фазных сорбентов. Эти слои наносят из растворителя, содержащего ион-парный реагент, (обычно алкил-сульфокислоты или тетраалкиламмониевые основания), пропуская его через сорбент для обращенно-фазной хроматографии. Ион-парная обращенно-фазная хроматография является методом анализа смеси ионизирующихся и неионизирующихся веществ.

Многие производители сорбентов не выпускают полного ассортимента сорбентов всех описанных выше типов, поскольку ограниченный спрос на такие сорбенты не окупает затрат на их разработку и производство. Есть фирмы, выпускающие не только все перечисленные сорбенты, но и дополнительно ряд других с привитыми нитрогруппами, карбокси- и карбоксиметильными группами, оптически активными фазами и т.д. Практически все фирмы выпускают основной ассортимент привитых фаз, который включает C8, C18, нитрильную и аминофазы, различающиеся также по зернению.

Несмотря на большую и все возрастающую популярность сорбентов с привитыми фазами, до сих пор вопрос о механизмах разделения на них остается не совсем ясным и часто поднимается в дискуссиях, где высказываются различные, нередко противоположные мнения о их роли в процессах разделения. Если на разделение и удерживание влияет несколько механизмов, то вклад каждого определяется несколькими факторами; основными являются свойства поверхности сорбентов, состав элюента и химическая природа каждого из анализируемых веществ.

Рассмотрим концепции о действии механизмов разделения, например в случае обращенно-фазных сорбентов, получивших наибольшее распространение.

Первоначальное представление о работе обращенно-фазных сорбентов было высказано, когда перешли от нанесенных на силикагель полимерных жидких фаз (жидкостно-жидкостная хроматография) к октадецилтряхлорсилану и его аналогам, химически привитым на поверхность силикагеля в пелликулярных материалах, дававшим привитую довольно толстую полимерную пленку фазы. Поэтому первый подход к привитой фазе был как к пленке жидкости на носителе, разделение на которой происходит за счет разных коэффициентов распределения анализируемых веществ между двумя жидкостями - растворителем и привитой фазой, т.е. за счет абсорбции. Такой подход получил признание, как позволивший получить и предсказать линейную зависимость удерживания неполярных гомологов, таких, как алкилбензолы. Этот же подход был распространен в дальнейшем и на привитые монослои алкилсиланов, хотя здесь он представляется более удаленным от действительности, поскольку жидкости как таковой на поверхности нет, а есть только отдельные привитые химически молекулы, «раствориться» в которых молекула анализируемого вещества не может. В этом случае может идти речь о взаимодействии молекул привитой фазы и анализируемого вещества за счет межмолекулярных сил.

Первоначальное представление о механизме разделения на ращенных фазах оказалось верным, однако для веществ более сложного строения с функциональными группами отклонения были частыми и большими. Развитием этой концепции было предположение о том, что на поверхности обращенно-фазного сорбента из растворителя, который содержит подобий привитому слою компонент (метанол или ацетонитрил), и менее ему подобный (вода), образуется удерживаемый силами адсорбции слой жидкой фазы, обогащенный менее полярными компонентами (метанолом). Этот слой имеет другой состав, чем подвижная фаза, и заметно отличается от привитой фазы по своей природе. Поэтому, участвуя в разделении анализируемых веществ, такой слой сильно взаимодействует с полярными группами веществ по другому механизму, чем привитой слой.

Для более полного представления о сложности механизмов разделения следует учесть, что силанольные группы, пространственно недоступные при прививке неподвижной фазы из-за большого объема триметилсилил-, диметилоктадецилсилил или диметилоктилсилильных групп, остаются на поверхности сорбента в большом количестве (около половины от имевшихся на поверхности исходного силикагеля). Они являются пространственно доступными для малообъемных небольших молекул, таких, как молекулы воды, метанола, ацетонитрила, которые способны взаимодействовать с ними, давая поляризованные слои растворителей также другого состава и свойств, чем использованный растворитель. Эти поляризованные молекулы также взаимодействуют с молекулами анализируемых веществ и дают свой вклад в удерживание. Наконец, силанольные группы имеют слабокислотную функцию и могут участвовать в разделении, действуя как ионообменники, взаимодействуя не только с анализируемыми веществами, но и извлекая ионы металлов переменной валентности, такие как железо, хром, никель и другие присутствовавшие в растворителе, пробе или образующиеся в результате коррозионных процессов в аппаратуре. Показано, чтo на поверхности сорбента, находящегося в аналитической бращенно-фазной колонке размером 4,6 Х 250 мм, может сорбироваться более десяти микрограммов железа. Ионы металлов переменной валентности также участвуют в разделении, взаимодействуя с некоторыми из анализируемых веществ. Вклад в разделение вносят и эксклюзионные процессы, по-разному действующие на молекулы малой и большой молекулярной массы.

Таким образом, оценить по параметрам удерживания вклад каждого из механизмов разделения и сформулировать гипотезу возможно применительно к молекулам родственного строения; для достаточно сложных молекул или смесей, очевидно, еще долго это не будет возможным даже при использовании мощного математического аппарата. Выбор оптимальных условий разделения с учетом возможных механизмов взаимодействия сорбента и анализируемых компонентов смесей еще долго будет оставаться основной проблемой при разработке аналитических методик в ВЭЖХ.

Литература

Fitzpatrick F.A., Wanalda M.A., Kaiser D.G./Anal. chem, 1977, v. 49, p. 1032.

Dunlap K.L., Sandridge R.L., Keller /./Anal. Chem, 1976, v. 48, p. 297.

Poole C. F, e. a./J. High Resol. Chromatogr. Commun., 1978, v. 1, p. 83.

Denkert M. e. a./J. Chromatogr, 1981, v. 218, p. 31-43.

Bartha A. e. a./J. Chromatogr, 1984, v. 303, p. 29-38.

Gloor R., Johnson E.L./J. Chromatogr. Sci, 1977, v. 15, p. 413-423.

Kraak J.C., Jonker K.M., Huber J.F.K./J. Chromatogr, 1977, v. 142, p. 671-680.

Wehli A. e. a./J. Chromatogr, 1979, v. 149, p. 199-210.

Даванков В.Л. / Журн. ВХО им. Менделеева, 1983, т. XXVIII, №1, с. 25-29.

Даванков В.А. // в кн. Прикладная хроматография / Под ред. К.И. Сако-дынского. М, Наука, 1984, с. 24-32.

Davankov V.A., Kurganov A.A., Bochkov A.S./fln Advances in Chroma-tography/ed. J.C. Giddings e. a. N. Y, M. Dekker, 1983, v. 22, p. 139 - 185.

Apffel J.A., Alfredson T.V., Major R.E./J. Chromatogr, 1981, v. 206, p. 43-57.

Страницы: 1, 2, 3