Хроматографическое разделение углеводов

4

4

“Хроматографическое разделение углеводов”

ВВЕДЕНИЕ: ХРОМАТОГРАФИЯ

Хроматография (от греч. chroma, родительный падеж chromatos - цвет, краска), физико-химический метод разделения и анализа смесей, основанный на распределении их компонентов между двумя фазами - неподвижной и подвижной (элюент), протекающей через неподвижную.

Историческая справка. Метод разработан в 1903 М. Цветом, который показал, что при пропускании смеси растительных пигментов через слой бесцветного сорбента индивидуальные вещества располагаются в виде отдельных окрашенных зон. Полученный таким образом послойно окрашенный столбик сорбента Цвет назвал хроматограммой, а метод - хроматографией. Впоследствии термин "хроматограмма" стали относить к разным способам фиксации результатов многих видов хроматографии. Однако вплоть до 40-х гг. хроматография не получила должного развития. Лишь в 1941 А. Мартин и Р. Синг открыли метод распределительной хроматографии и показали его широкие возможности для исследования белков и углеводов. В 50-е гг. Мартин и американский учёный А.Джеймс разработали метод газо-жидкостной хроматографии.

ПУТИ РАЗВИТИЯ ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОГО АНАЛИЗА И ВОЗМОЖНОСТИ КЛАССИФИКАЦИИ ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИХ МЕТОДОВ

За последние годы в развитии теории и практики хроматографии имеются определенные успехи. Теория хроматографии получила успешное развитие в работах советских ученых С.Е. Бреслера, А.А. Жуховицкого, В.В. Рачинского, С.3. Рогинского, Г.В. Самсонова, О.М. Тодеса и Н.Н. Туницкого.

Однако теория хроматографии нуждается в дальнейшем углубленном развитии, в особенности в направлении предсказания оптимальных условий разделения сложных смесей в отдельных конкретных случаях, а также и в отношении учета особенностей сорбентов и носителей. Для решения сложных дифференциальных уравнений в настоящее время можно применять компьютерные методы, что позволяет значительно продвинуться в области теории хроматографии, освобождая исследователей от необходимости примене-ния приближенных методов решения. Недостаточно развивается также теория зависимости адсорбции и распределения веществ от их химиче-ского строения. В этом направлении были достигнуты успехи в работах А.В. Киселева, акад. П.А. Ребиндера.

П.А. Ребиндер вывел также правило уравнивания полярностей, имеющее важное значение для хроматографии. Хроматографические процессы на колонках и в толще бумаги в известной степени примыкают к области физико-механических процессов фильтрации истинных и коллоидных растворов, фильтрации и сорбции макромолекул, мицелл, эмульсий и суспензий.

Метод хроматографического анализа представляет собой один из видов физико-химического анализа, который отличается от других видов анализа в той же мере, в какой, например, весовой анализ от объемного.

Характерной чертой хроматографического метода является распреде-ление разделяемых веществ между двумя несмешивающимися фазами, приводящее к разделению компонентов данной смеси. При этом одна фаза может быть твердой, а другая газообразной или жидкой, или же обе фазы могут быть жидкими и помещенными на какой-либо носитель.

Вещества, заключающиеся в разделяемой смеси, в процессе хрома-тографического разделения перемещаются из одной фазы в другую.

Процесс хроматографического разделения смеси веществ состоит в пространственно-различном распределении каждого компонента данной смеси между двумя фазами, с последующим полным разделением смеси путем применения операции вымывания или вытеснения выделяемого вещества или получения осадка. Причиной такого разделения являются различия во взаимодействии каждого из компонентов данной смеси веществ, находящихся в первой фазе (растворитель), со второй фазой, называемой сорбентом (твердым или жидким), или с осадителем, помещенным на носителе.

Теоретически можно ожидать двух способов осуществления хроматографического процесса:

жидкая или газообразная фаза проходит через неподвижную твердую фазу (через колонку или мембрану);

твердый сорбент в виде зерен или мембраны перемещается в не-подвижной жидкой или газовой фазе, подвергаемой разделению.

Таким образом, нужно учитывать не только движение жидкости или газа через колонку сорбента или носителя, но и возможность движения сорбента или носителя через неподвижную жидкость или газ. Вероятно, могут быть предложены еще некоторые варианты хроматографических разделений, не укладывающиеся в эти типы разделений.

В основном хроматография является методом количественного раз-деления и определения компонентов сложной смеси. Это ее целевое на-значение. Поэтому усилия теории хроматографии должны быть направлены на достижение наибольших успехов в решении этой задачи, путем выяснения оптимальных условий разделения.

Формулировка особенностей хроматографического процесса должна предусматривать не только первоначальное распределение, но и последу-ющее промывание хроматограммы («проявление» по терминологии М. С. Цвета), обеспечивающее наиболее полное разделение компонентов данной смеси. Предложенная формулировка общих особенностей хрома-тографического процесса обращает внимание не только на причину разделения, но и учитывает характерные различия процессов разделения.

В реальном процессе хроматографии часто сочетаются различные виды сорбции, например молекулярная и ионообменная.

Первая существенная особенность хроматографических процессов -- это многократное повторение актов сорбции -- десорбции, ионного обмена или распределения между фазами и динамический характер этих процессов.

Вторая особенность -- наличие большой поверхности сорбента и большой поглотительной емкости.

Адсорбционной хроматографии применяется или промывание или вытеснение, в распределительной хроматографии -- только промывание, в ионообменной -- только вытеснение. Необходимо указать, что непосредственное получение зон чистых веществ в осадочной хроматографии объясняется тем, что операция проявления или вытеснения заменяется процессом выделения вещества в осадок, т. е. образованием новой, отдифференцированной фазы; пока не закончится выделение осадка одного состава, не начнется выделения осадка другого состава (Пример: две различные кристаллические модификации иодида ртути образуются на осадочных хроматограммах раздельно, так как они имеют различную растворимость).

На практике трудно осуществить в чистом виде только молекулярную, только полярную или только гомеополярную сорбции. Они всегда сочетаются в реальном хроматографическом процессе. Нужно принимать во внимание особенности сорбентов и носителей, учитывая, что не существует несорбирующих носителей, и что различные механизмы хроматографического процесса протекают одновременно и параллельно.

В свете высказанных соображений очень интересна работа В. И, Па-рамоновой с сотрудниками, предложившей изучать состояние вещества в растворе методом выходных кривых. Этим методом удалось доказать одновременное существование в растворе исследуемого химического эле-мента -- катионов, анионов, коллоидных частиц и нейтральных молекул. При этом применялись также и другие методы исследования, как, например, ультрафильтрование, диализ, электродиализ.

В работе В.А. Алесковского описан метод тонущих частиц, при-меняемый для анализа весьма разбавленных растворов и представляю-щих пример движения сорбента через толщу раствора.

Различные приемы хроматографии в настоящее время получают все большее применение, как методы химического анализа. В особенности ценно то, что хроматография открывает новые возможности системати-ческого или дробного бессероводородного метода анализа.

Различные виды хроматографических процессов могут быть сопо-ставлены на следующей схеме (табл. 1).

В 1951 г. Стрейн предложил различать четыре вида хроматогра-фии (табл. 2).

Наряду с этим Стрейн дал также классификацию подвижной жидкой фазы, применяемой в различных видах хроматографических процессов (табл. 3).

Методы распределительной и ионообменной хроматографии целесооб-разно сопоставить с другими методами анализа, например с такими, как микрокристаллоскопический, капельный, дробный и др.

Деление хроматографии на молекулярную, ионообменную, распреде-лительную, осадочную и другие ее виды можно сравнить с подразде-лением количественного объемного анализа на методы нейтрализации, окисления-восстановления, осаждения и комплексообразования. Совре-менная хроматография оказалась применимой как для качественных, так и для количественных определений./1/

Термины и определения

СОРБЕНТ -- твердое вещество, жидкость или их смеси, способные поглощать или удерживать газы, пары или растворенные вещества и используемые в хроматографии в качестве неподвижной фазы.

АДСОРБЕНТ -- твердый сорбент, концентрирующий на своей поверхности газы, пары или растворенные вещества. Адсорбентом заполнена хроматографическая колонка, в которой, в свою очередь, происходит разделение смеси веществ на отдельные компоненты.

СОРБАТ -- компонент анализируемой смеси, внесенной в хроматографическую колонку.

ЭЛЮЕНТ -- растворитель или смесь растворителей, предназначенная для прокачки анализируемой смеси через хроматографическую колонку (подвижная фаза).

ЭЛЮАТ -- раствор, выходящий из хроматографической колонки.

ХРОМАТОГРАММА -- графический результат хроматографического процесса. Хроматограммой (с точки зрения аппаратурного оформления) можно назвать зависимость отклика детектора хроматографа от времени при прохождении элюата через ячейку детектора. Хромато грамма состоит из ряда пиков, каждый из которых при полном разделении соответствует одному компоненту анализируемой пробы (рис.2). Площадь или высота пика должна быть пропорциональна концентрации компонента в элюате.

ХРОМАТОГРАФИЧЕСКАЯ СИСТЕМА состоит из хроматографической колонки, заполненной определенным адсорбентом, через которую при определенной температуре прокачивается элюент определенного состава. ВРЕМЯ УДЕРЖИВАНИЯ ВЕЩЕСТВА -- время пребывания исследуемого вещества в хроматографе. На практике время удерживания определяют от момента ввода пробы вещества в хроматограф до момента регистрации максимума сигнала детектора. Каждое вещество при одних и тех же хроматографических условиях имеет свое время удерживания.

ВРЕМЯ УДЕРЖИВАНИЯ НЕСОРБИРУЕМОГО ВЕЩЕСТВА-- время удерживания вещества, которое не адсорбируется (не удерживается) адсорбентом.

Рис. 1 Хроматограмма.

А -- амплитуда отклика детектора,

Т -- время, мин.,

tRi -- времена удерживания хроматографических пиков,

t'R1-- исправленные времена удерживания,

tM -- время удерживания несорбируемого вещества.

Углеводы

Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6