p align="left">ОБНАРУЖЕНИЕ. Для установления положения зон на хроматограмме предложен ряд методов: а) опрыскивание пластинки реагентами, не разрушающими сахаров, например иодом, родамином В, бромтимоловым синим, 2/,7/-дихлорфлуоресцеином или водой; б) добавление к сорбенту флуоресцентных индикаторов и обнаружение зон в ультрафиолетовом свете; в) опрыскивание части слоя, перенесенного с хроматограммы на липкую ленту или пластинку, реагентами, вызывающими деструкцию сахаров; г) опрыскивание части пластинки деструктивными реагентами, например серной кислотой (предварительно большую часть хроматограммы защищают). Последний метод применяется редко, так как, во-первых, при этом теряется существенное количество вещества, а во-вторых, как правило, приходится прокаливать пластинку. После того как положение зон установлено, их соскабливают с пластинки шпателем или собирают «вакуум-очистителем». Можно также элюировать соединение с хроматограммы на фильтровальную бумагу. Далее к сорбенту добавляют растворитель и осадок отделяют фильтрованием или центрифугированием. Для экстракции вещества можно пользоваться аппаратом Сокслета. По возможности следует избегать употребления полярных растворителей, поскольку некоторые сорбенты в них растворяются. Разделение сахаров методом препаративной ТСХ рассматривается на примере разделения смеси аномерных метил-2,3,6-три-О-бензил-4-О-этил-,-D-глюкопиранозидов. МЕТОДИКА ПРИГОТОВЛЕНИЕ ПЛАСТИНКИ. Суспензию 25 г силикагеля Н в 66 мл дистиллированной воды перемешивают в стакане стеклянной палочкой в течение 5 мин (до получения однородной массы) и выливают на чистую пластинку размером 20х20 см. Держа пластинку в руках, наклоняют ее в разные стороны так, чтобы суспензия равномерно распределилась по всей поверхности. Пластинку сначала помещают на горизонтальную подставку и выдерживают 2 ч при 25 °С, а затем переносят на подставку для хранения, где она сушится примерно 12 ч на воздухе. Пластинку активируют 2 ч при 130°С и медленно охлаждают до ~25°С. После того как края слоя выровнены шпателем, можно наносить образец. Толщина слоя сорбента 2 мм. НАНЕСЕНИЕ ОБРАЗЦА. В кончик пипетки помещают тонкий ватный тампон таким образом, чтобы часть его (3--5 мм) оставалась снаружи. Раствор 0,3--0,5 г смеси аномерных метил-2,3,6-три-O-бензил-4-O-этил-D-глюкопиранозидов в 1--2 мл хлороформа засасывают в пипетку и наносят в виде полосы на пластинку на расстоянии 2 см от ее нижнего края и 3 см от боковых краев. Чтобы полоса получилась узкой (0,5 см), необходимо между нанесениями дать хлороформу испариться. При разделении смесей рассматриваемого типа в центре пластинки, пока она еще не высохла, отчетливо видны две полосы, расположенные на расстоянии 1 см. Эти полосы, соответствующие - и -D-гликозидам, видны также на сухой пластинке в длинноволновом УФ-свете. Обнаруженные зоны собирают с пластинки, используя «вакуум-очиститель». Последний представляет собой стеклянную трубку диаметром 25 мм; на одном конце трубки имеется отверстие диаметром 6 мм, через которое засасывается сорбент. Другой конец трубки присоединен к вакуум-насосу. Для улавливания сорбента в трубку помещают кусок стеклянной ваты. К попавшему в трубку сорбенту добавляют хлороформ (20 мл), осадок отфильтровывают и промывают 20 мл хлороформа. Фильтрат упаривают при пониженном давлении и остаток повторно растворяют в хлороформе, чтобы удалить все следы сорбента. Из нижней зоны выделяют в виде бесцветного сиропа метил-2,3,6-три-О-бензил-4-О-этил--D-глюкопиранозид. Из верхней зоны выделяют метил-2,3,6-три-O-бензил-4-O-этил--D-глюкопиранозид. 5. РАСПРЕДЕЛИТЕЛЬНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ НА ИОНООБМЕННЫХ СМОЛАХ Впервые разделение углеводов методом распределительной хроматографии на ионообменных смолах в смесях растворителей различной полярности было описано в 1952 г. В последние годы метод был значительно усовершенствован. В качестве элюента при разделении сахаров и их производных наиболее пригоден водный спирт, и далее речь будет идти только об этом элюенте. Одним из основных факторов, обусловливающих сорбцию сахаров точно так же, как и других полярных неэлектролитов в данном виде хроматографии, является неодинаковое распределение компонентов элюирующей смеси между смолой и внешним раствором. В случае водного спирта относительное количество воды в неподвижной фазе выше, чем в подвижной, и этим объясняется тот факт, что смолой преимущественно удерживаются полярные вещества. На состав подвижной и неподвижной фаз существенное влияние оказывает также взаимодействие смола - растворитель и смола - растворенное вещество. При смене противоиона порядок элюирования некоторых сахаров может измениться. Коэффициенты распределения веществ возрастают с увеличением концентрации спирта и уменьшаются с повышением температуры. За редким исключением, коэффициенты распределения растут с увеличением числа гидроксильных групп в молекуле. Введение в молекулу неполярных групп, например метильных, приводит к уменьшению коэффициента распределения. Величина последнего зависит также от положения заместителей. В табл.5 приведены коэффициенты распределения ряда свободных сахаров. Распределительная хроматография на ионообменных смолах была с успехом применена для разделения моно- и олигосахаридов, альдитов и производных сахаров, не содержащих ионогенных группировок, например гликозидов и частично метилированных сахаров. Этот метод можно использовать как в аналитических, так и в препаративных целях. Таблица 5. Коэффициенты объемного распределения (Dv) некоторых моносахаридов и ангидросахаров при различных температурах и концентрациях спирта |
Сахара | Пористая смола (SO42-) 75°С | Смола малой Емкости (SO42-) 75 °С | Дауэкс (SO42-) 90°С | Дауэкс (Li+) 75 °С | Амберлит IR-120 (Li+) | | | | | | | 75 °С | 100 °С | | Концентрация этанола, % | | | | 88 | 86 | 90 | 86 | 92,4 | 92,4 | | Эритроза | 3,08 | | | | 1,9 | | | | Треоза | 3,84 | | | | 1,4 | | | | Рибоза | 6,55 | 4,06 | 5,80 | 4,98 | | 4,0 | 3,1 | | Арабиноза | 10,1 | 6,26 | 9,79 | 7,56 | | 3,8 | 3,0 | | Ксилоза | 12,5 | 7,38 | 12,1 | 9,19 | 2,7 | 3,0 | 2,4 | | Фруктоза | 13,5 | 8,04 | 13,8 | 10,3 | | 5,6 | 4,3 | | Сорбоза | | 8,93 | 15,6 | 11,0 | | 4,6 | 3,7 | | Манноза | 16,4 | 9,37 | 16,9 | 11,8 | | 5,3 | 4,4 | | Галактоза | 23,4 | 13,0 | 24,4 | 16,1 | 5 7 | 6,8 | 5,3 | | Глюкоза | 28,1 | 14,9 | 29,5 | 19,5 | 4 8 | 5,4 | 4,4 | | Альтроза | 16,6 | | | | 4 2 | | | | Рамноза | 4,75 | 2,80 | 4,11 | 3,54 | | 1.4 | 1,2 | | Фукоза | | 3,25 | 4,96 | 4,19 | | 2,4 | 1,8 | | |
На рис.4 приведена принципиальная схема прибора, используемого для разделения сахаров. Элюент (спирт -- вода) помещают в колбу Мариотта и обезгаживают кипячением, чтобы предотвратить появление пузырьков воздуха в колонке. За колбой расположена открытая градуированная трубка, обычно заполненная элюентом. Скорость движения элюента в системе регулируют, перекрывая выходное отверстие колбы. Элюент подается в колонку поршневым насосом из нержавеющей стали который помещают ниже остальных аппаратов системы элюирования.. Рис. 4 Аппаратура для проведения хроматографического разделения и автоматического анализа сахаров орциновым методом. Давление измеряют манометром Бурдона, снабжённым прерывателем. Последний отключает насос и нагреватель, если давление в системе превышает норму (80 атм) и также если оно падает из-за утечки жидкости. Анализ можно проводить на колонках, имеющих пористое дно и тефлоновое уплотнение на верхнем конце колонки. Если работа ведется при высоком давлении, не рекомендуется пользоваться колонками со стеклянными фланцами. Вместо них можно использовать стеклянные трубки с приклеенными эпоксидной смолой муфтами из поливинилхлорида. Чтобы в колонке поддерживалась требуемая температура(70-90 °С), по рубашке колонки циркулирует вода из термостата. Повышение температуры колонки приводит к сужению зон вымываемых веществ и снижению рабочего давления. Смолы, применяемые в распределительной хроматографии, представляют собой сильноосновные аниониты или сильнокислые катиониты, основу которых составляет сополимер стирола и дивинилбензол. В аналитических колонках, диаметр которых равен 2--6 мм, а скорости элюирования высокие (8--20 мл-см-2мин-1), рекомендуется использовать мелкозернистые смолы с размером частиц 8--13 или 10--15 мкм. Для препаративнго разделения сахаров на широких колонках (диаметр 12--25 мм) и при меньшей скорости элюирования можно применять более грубые смолы. Колонку промывают элюентом до тех пор, пока не образуется однородный слой ионита. После этого растворитель, находящийся над слоем смолы, отсасывают, в колонку переносят новую порцию суспензии и операцию повторяют. Перед хроматографическим разделением заполненную колонку приводят в состояние равновесия с элюентом данного состава, промывая ее элюентом не менее 16 ч. АНАЛИЗИРУЮЩАЯ СИСТЕМА. Определение сахаров и их различных производных в элюате удобно проводить автоматически орциновым методом. Раствор реагентов хранят в бутыли из темного стекла, откуда он и подается в систему при помощи поршневого насоса. Между насосом и тройником, в котором происходит смешение элюата с раствором красителя, расположено устройство для гашения (демпфирования) пульсаций давления (рис. 4). Смесь элюата с раствором красителя пропускают через змеевик длиной 20 м и диаметром 1,2 мм, погруженный в термостатируемую полигликолевую баню (100°С). Время нахождения смеси в змеевике около 10 мин. Интенсивность окраски раствора определяется спектрофотометрически при 420 нм проточных кюветах с l 2--15 мм. Удобно пользоваться системой из двух последовательно соединенных кювет разной длины: если на более длинной кювете самописец «зашкаливает», измерения проводят на более короткой кювете. На колонке диаметром 4 мм удается разделить и проанализировать от 2 до 20 мкг веществ. На колонках меньшего или большего диаметра можно проанализировать соответственно меньшее или большее количество смеси. Достоинством вышеописанной схемы анализа является высокая точность количественного определения и отсутствие необходимости в частом построении калибровочных кривых (при постоянстве условий анализа). Если удается достичь полного разделения компонентов, отклонение от среднего значения в двух аналогичных анализах составляет 1енее 1%. Однако весь элюат расходуется за одно определение, и потому не удается провести дополнительное исследование фракций. Если проводится препаративное разделение или если проводимые исследования требуют повторного разделения и дополнительных анализов компонентов смеси, то для разделения потока элюата и введения растворов реагентов следует использовать перистальтический насос. Такая схема анализа (рис. 5) отличается большей гибкостью, однако недостатком ее является более низкая точность количественных определений в связи с тем, что соединительные трубки насоса быстро изнашиваются и их приходится менять через 14 дней. Рис. 5. Двухканальный анализатор для одновременного определения восстанавливающих сахаров и альдитов. М- сместители; Р1 и Р2 - гасители пульсации; L - флуоресцентная лампа трубки; А - орционный канал: 16-ти % водный раствор орциона, 60% серная кислота; В - периодат-формальгидный канал: 0,015Мметапериодат натрия, содержащий 5 мл конц. соляной кислоты на литр На рис.5 приведена схема анализа с применением перистальтического насоса. Элюат делится на три потока и одновременно анализируется орциновым (А) и периодат-формальдегидным (В) методами. Третий поток подается на коллектор фракций или отбрасывается. В элюате дополнительно определяют содержание восстанавливающих сахаров периодатным или феррицианидным методом. Выделенные ациклические альдиты анализируются автоматически периодат-формальдегидным методом. В кислой среде они окисляются периодатом с образованием формальдегида, который определяют до реакции с пентандионом-2,4 в растворе ацетата аммония. Избыток периодата предварительно восстанавливают арсенитом. В условиях анализа при окислении большинства альдитов образуется с высоким выходом формальдегид, в то время как при окислении большей части альдоз формальдегид образуется лишь в незначительных, с трудом детектируемых количествах. Исключение составляет D-фруктоза, ее можно достаточно точно определить этим методом. Периодат-формальдегидегидный метод в совокупности с орциновым используется для анализа сложных смесей сахаров и альдитов. Точность его сравнима с точностью орцинового метода. 6. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ХРОМАТОГРАФИИ НА БУМАГЕ ДЛЯ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ САХАРОВ В РАСТИТЕЛЬНОМ МАТЕРИАЛЕ В последнее время хроматографию на бумаге все чаще начинают использовать в качестве самостоятельного количественного метода. При этом весьма широкое распространение получает количественная хроматография углеводов: моно-, ди- и олигосахаридов, а также продуктов гидролиза крахмала, целлюлозы и других полимеров. Количественное определение индивидуальных веществ, разделяемых на хроматограммах, производится различными способами. Существует ряд методов, при помощи которых можно определить концентрацию разделенных веществ непосредственно на бумаге. Это методы: визуальное сравнение (полуколичественный), измерение площади пятен, измерение интенсивности окраски пятен, определение максимальной плотности окраски пятен. В случае работы с радиоактивными веществами можно легко установить активность этих соединений при помощи счетчика Гейгера -- Мюллера. Однако более широко применяемым и, по-видимому, наиболее точным методом является элюирование отдельных соединений с последующим колориметрированием или определением поглощения в ультрафиолетовой области. При работе с радиоактивными веществами можно производить измерение общей или удельной активности элюируемого вещества. Точность методов количественного хроматографического анализа равна 10%. 7. ГАЗОЖИДКОСТНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ ТРИМЕТИЛСИЛИЛЬНЫХ ПРОИЗВОДНЫХ САХАРОВ Газожидкостная хроматография (ГЖХ) триметилсилиловых эфиров (ТМС) производных углеводов представляет собой хорошо отработанный метод, который в течение ряда лет используется для анализа сложных смесей сахаров, таких, как кукурузная патока или в общем случае гидролизаты полисахаридов. С совершенствованием методов силилирования создавалась новая хроматографическая аппаратура и изыскивались новые жидкие фазы. Все это позволило не только улучшить разделение сложных смесей сахаров, но и расширить область применения ГЖХ вплоть до разделения гептасахаридов. Бробст и Лотт разработали метод, позволяющий проводить анализ образцов, содержащих небольшие количества воды, и, используя его, смогли определить олигосахаридный состав кукурузной патоки вплоть до тетрасахаридов. Позднее в качестве силилирующего агента стал использоваться N-(триметилсилил) имидазол и смесь его с пиридином, ставшая коммерческим реактивом. Показано, что данный реактив обладает хорошими растворяющими свойствами и может использоваться для силилирования влажных образцов сахаров. Этот метод не только допускает наличие в образце до 40 мг воды, но и существенно увеличивает устойчивость триметилсилиловых эфиров, так как в смеси присутствует большой избыток реагента. Поэтому стандартная калибровочная смесь устойчива в течение нескольких месяцев, что весьма важно для хранения контрольных образцов редких олигосахаридов. 8. ГАЗОЖИДКОСТНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ МЕТИЛИРОВАННЫХ САХАРОВ Газожидкостная хроматография представляет собой надежный и широко распространенный метод качественного и количественного анализа сахаров. Разделение методом ГЖХ метиловых эфиров сахаров и их производных приобрело особенно большое значение при исследовании структуры олиго- и полисахаридов. Восстанавливающие метилированные сахара нельзя изучать методом ГЖХ в первую очередь потому, что они прочно сорбируются на неподвижной фазе или носителе, и их, как правило, переводят в метилгликозиды. Последние либо непосредственно анализируют на газовом хроматографе, либо, если время удерживания метилгликозидов слишком велико, предварительно ацетилируют или силилируют. Иногда разрешающая способность колонки недостаточна для разделения аномеров пиранозных и фуранозных форм некоторых метилированных гликозидов или их производных. В таком случае метилированные сахара анализируют в виде ацетатов или триметилсилиловых эфиров альдитов. Как было установлено, детекторы дают различный отклик на различные метилированные сахара, содержащиеся в одинаковых концентрациях. Однако пока не известно, является ли это следствием особенностей, присущих детекторам, или следствием потерь некоторых компонентов при подготовке образца к анализу и преимущественной сорбции их на колонке. Твердые правила выбора колонки еще не выработаны. Тем не менее изучение литературных данных показывает, что большинство исследователей предпочитают полярные фазы, которые, по-видимому, дают лучшее разрешение всех типов производных метилированных сахаров. Обычно время удерживания соединения выражают по отношению ко времени удерживания стандарта. Это позволяет избежать расхождений, наблюдаемых для абсолютных значений времени удерживания и обусловленных нестандартностью условий анализа. Результаты определения относительного времени удерживания на одной и той же колонке воспроизводятся с точностью до ±2%, а на разных колонках с одинаковыми неподвижными фазами - с точностью до ±5%. Время удерживания многих производных углеводов достаточно велико, что приводит к плохому разделению смесей, обусловливает низкую концентрацию элюируемых компонентов в газе-носителе, и в итоге приводит к увеличению ошибки при определении содержания компонентов в смесях. Поэтому при проведении разделения метилированных сахаров желательно подбирать такие производные и такие условия работы, при которых все компоненты смеси элюировались бы с колонки в течение 70--90 мин с момента их введения. Если детектирование не сопровождается разрушением сахаров, их можно собирать на выходе с хроматографа. Заключение Хроматографические методы при разделении и очистке полисахаридов, так же как и в других областях химии природных соединений, играют исключительно важную роль. Однако вследствие своеобразия полисахаридов далеко не все разновидности хроматографии используются в равной мере. Наличие даже в очищенных полисахаридах набора полимерогомологов с близкой хроматографической подвижностью и близкими сорбционными свойствами, их коллоидный характер, а также склонности к ассоциациям - все это обусловливает малую эффективность таких видов хроматографии, как бумажная, распределительная и адсорбционная хроматография. Вместе с тем ионообменная хроматография имеет исключительно важное значение при разделении и очистке полисахаридов. Широко применяемые ДЭАЭ-целлюлоза и эктеолацеллюлоза позволяют легко отделить нейтральные и кислые полисахариды: нейтральные обычно не задерживаются или мало задерживаются на названных анионитах, кислые, в зависимости от своей природы, более или менее прочно удерживаются и элюируются растворами солей, буферными растворами или щелочами. На анионитах разделяются различные кислые полисахариды в зависимости от степени их кислотности. Применение ДЭАЭ-целлюлозы в боратной форме позволяет разделять и нейтральные полисахариды. Недавно были разделены нейтральные полисахариды (гликоген) при помощи ДЭАЭ-целлюлозы на фракции, отличающиеся величиной частиц./3/ Для разделения сахаров применяются следующие методы: 1. Хроматография на колонках с углем применяется для разделения углеводов на классы в зависимости от степени их полимеризации (моносахариды, дисахариды, трисахариды т. д.). 2. Хроматография на колонке с целлюлозой имеет широкую область применения, что нет необходимости рассматривать частные примеры его использования. 3. Качественная тонкослойная хроматография применяется для разделения углеводов, в том числе незамещенных моно- и олигосахаридов и различных производных сахаров и сложных эфиров, циклических ацеталей и др. 4. Количественная тонкослойная хроматография сахаров может применяться в случае смесей, компоненты которых можно полностью разделить 5. Препаративная тонкослойная хроматография сахаров используется для разделения смеси аномерных сахаров( метил-2,3,6-три-О-бензил-4-О-этил-,-D-глюкопиранозидов). 6. Газожидкостная хроматография используется для разделения триметилсилильных производных сахаров, метилированных сахаров. Из своей теоретической работы я могу сделать следующие выводы: - для идентификации олигосахаридов наилучшим методом считается бумажная хроматография - для разделения сахаров наилучшим методом считается тонкослойная хроматография. СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ: 1. Чмутов К.В. Хроматография, ее теория и применение. - М.: Издательство Академии наук СССР -1960г. 2. Хомченко Г.П. Химия для поступающих в вузы: Учеб. пособие. 2-е изд., -М.: В. ш., 1995г. 3. Степаненко Б.Н. Химия и биохимия углеводов (полисахариды): Учеб. пособие для вузов. - М.: Высш. школа, 1978г. 4. Жуховицкий А.А. Руководство по газовой хроматографии. - М.: Мир, 1969г. 5. Кочетков Н.К. Методы химии углеводов. - М.: Мир, 1967г. 6. Хорлин А.Я.Методы исследования углеводов.- М.:Мир, 1975г
Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6
|