Для специальных целей разделения представляет интерес такой вид распределительной хроматографии, при котором используется различная способность компонентов к обратимому комплексообразованию с неподвижной фазой или с добавленным к ней веществом. Этот вид хроматографии (хроматография, основанная на комплексообразовании) делает возможным селективное разделение индивидуальных веществ или классов соединений.

Как показали Кремер и Мюллер (1951г), при применении адсорбентов в качестве неподвижной фазы в некоторых случаях переход вещества про-исходит не между подвижной фазой и адсорбентом, а между подвижной фазой и адсорбционным слоем, покрывающим адсорбент (хроматография с использованием адсорбционных слоев). Розелиус (1957) добился разделения инертных газов на адсорбционном слое из двуокиси углерода. Следовательно, неподвижной фазой в данном случае был газ.

Описанные виды хроматографии почти все экспериментально осуще-ствлены как с газообразной, так и с жидкой подвижными фазами. Целесооб-разно принять следующие их названия: распределительная газовая хроматография, газоадсорбционная хроматография на молекулярных ситах, адсорбционно-жидкостная хроматография, обменно-жидкостная хроматография.

На практике наблюдаются многочисленные промежуточные виды хро-матографии. Хроматография, основанная на комплексообразовании, всегда связывается с распределительной хроматографией, потому что комплексообразователь находится в жидкости. Между адсорбционной и распределительной хроматографиями не существует резкого разграничения. С одной стороны, на поверхности носителя, как покрытой, так и не покрытой жидкостью, может иметь место адсорбция, с другой -- адсорбционную хроматографию можно частично приблизить к распределительной путем модификации адсорбентов. Примером этого может служить хроматография на адсорбционных слоях. Наконец, при низких температурах колонок может проявиться адсорбция на поверхности жидкой неподвижной фазы.

Четкое разграничение отдельных видов хроматографии, очевидно, невозможно. Дести (1957) предложил в связи с этим классификацию только на основе агрегатного состояния обеих фаз:

хроматография газ -- жидкость (ГЖХ),

хроматография газ -- твердое тело (ГТХ),

хроматография жидкость -- жидкость (ЖЖХ),

хроматография жидкость -- твердое тело (ЖТХ).

Принцип действия жидкостного хроматографа

Рис. 2 Схема жидкостного хроматографа.

Любой жидкостной хроматограф состоит из следующих частей:

1 -- насос;

2 -- узел ввода пробы;

3 -- хроматографическая колонка;

4 -- детектор;

5 -- регистратор (самописец, интегратор или компьютер);

6 -- термостат колонок;

7 -- узел подготовки элюента с емкостями для элюента;

8 -- слив элюата или коллектор фракций.

Принцип действия хроматографа заключается в следующем: раствор анализируемой смеси с помощью УЗЛА ВВОДА ПРОБЫ вводится в верхнюю часть хроматографической КОЛОНКИ. С помощь НАСОСА анализируемая смесь прокачивается элюентом через хромотографическую КОЛОНКУ, в которой происходит разделение анализируемой смеси на отдельные вещества (компоненты). Вытекающий из колонки ЭЛЮАТ, содержащий отдельные компоненты анализируемой смеси, детектируется ДЕТЕКТОРОМ, показания которого регистрируются РЕГИСТРАТОРОМ.

Рис.3. Схема газохроматографической установки.

1 -- баллон со сжатым газом-носителем; 2 -- вентиль; 3 -- регулятор и измеритель скорости газа-носителя; 4 -- дозатор; ,5 -- проба; 6 -- хроматографическая колонка; 7 -- детектор; 8 -- выход газа; 9 -- питание детектора; 10 -- преобразователь сигналов; 11 -- ленточный самописец; 12 -- терморегулятор; 13 -- термостат.

ПРИМЕРЫ ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОГО РАЗДЕЛЕНИЕ УГЛЕВОДОВ

1. Хроматография на колонках с углем/5/

Колоночная хроматография на угле была впервые описана в 1950 г.Уистлером и Дерсо. Они использовали этот метод для разделения углеводов на классы в зависимости от степени их полимеризации, т. е. моносахариды, дисахариды, трисахариды и т. д.

Согласно работе, разделение проводилось как ступенчатое элюирование углеводов водным спиртом из колонки, содержащей смесь угля с целитом. Этот метод получил распространение и особенно широко применялся для разделения серии гомологичных олигосахаридов. Однако разделения более сложных смесей, например олигосахаридов одного и того же класса, необходимо градиентное элюирование.

Хроматография на колонках с углем пригодна не только для разделения олигосахаридов, она также применялась для разделения кислых углеводов, многоатомных спиртов и их ацетатов, олигосахаридов, содержащих аминосахара, и метиловых эфиров сахаров. В каждом случае хроматография на угольных колонках, по-видимому, превосходит все другие методы, так как позволяет добиться желаемого разделения; однако, если нужно разделить сложную смесь, обычно необходимо предварительное градиентное элюирование. Новый метод разделения дисахаридов был опубликован в 1955 г.; он основан на способности некоторых дисахаридов образовывать в мягких условиях метилфуранозиды. Эти метилглюкозиды абсорбируются сильнее свободных сахаров.

Хроматография на угольной колонке удобна еще и тем, что угольная колонка обладает высокой емкостью, а это позволяет количественно выделить компоненты и разделить большие количества материала. На эффективность разделения не влияет присутствие неорганических солей или степень разведения раствора сахара. В лабораториях некоторых исследователей для дезактивации угля применялась концентрированная соляная кислота. Элм, Вильямс и Тизелиус насыщали уголь стеариновой кислотой (1% кислоты в 96%-ном спирте). Предварительная дезактивация или насыщение увеличивает возврат введенных в колонку веществ почти до 100%, позволяет элюировать сильно адсорбирующиеся высшие олигосахариды и улучшает разрешение зон. Чтобы исключить малое количество растворенного неорганического вещества, вносимое с наполнителем, указанные авторы часто считали удобным готовить колонки без целита. Если исключить целит проведение операций значительно упрощается в том случае, когда вместе целита применяют уголь двух степеней измельчения: смесь крупнозернистого угля и обычного дарко G-60.

МЕТОДИКА. (описано применение колонки, содержащей только уголь.). Равные весовые части угля дарко G-60 и целита № 535 смешивают в сухом виде, к смеси прибавляют воду и полученную жидкую пасту помещают в стеклянную хроматографическую колонку, закрытую снизу стеклянной ватой. Через колонку медленно, по каплям пропускают концентрированную соляную кислоту, чтобы дезактивировать уголь и отмыть следы железа и золы. После этого через колонку пропускают дистиллированную воду до получения нейтрального элюата. Для уменьшения длительности операций на этой и всех последующих стадиях можно применять отсасывание.

Сахара вводят в колонку в виде водного обычно 1--10%-ного раствора. Для эффективного разделения на каждый грамм смеси сахаров берут 150 мл смеси угля и целита. Разделение сахаров можно проводить как ступенчатым, так и градиентным элюированием. Например, смесь, содержащая по 1 г d-глюкозы, мальтозы и рафинозы, была разделена в колонке 3,4 X 17,0 см последовательным элюированием 800 мл воды, 1500 мл 5%-ного спирта и 700 мл 15%-ного спирта.

Для того чтобы избавиться от растворенного неорганического вещества, которое неизбежно сопутствует в целите, обычно применяют два метода. Так как неорганическое вещество становится относительно мало растворимым, после того как оно было высушено, исследуемый образец выпаривают досуха, смешивают с небольшим количеством воды и фильтруют. Такую операцию повторяют трижды, и этого обычно достаточно для удаления неорганического вещества. Другой способ заключается в следующем: к водному раствору прибавляют метиловый или этиловый спирт, смесь нагревают до 60° и выпавший хлопьевидный осадок удаляют фильтрованием.

2. Хроматография на колонке с целлюлозой/5/

Распределительная хроматография была впервые применена для разделения углеводов в 1949 г. С тех пор этот метод широко исполь-зуется в препаративной химии углеводов. Область применения этого метода в химии углеводов настолько обширна, что нет необходимости рассматривать частные примеры его использования.

МЕТОДИКА. В качестве колонок можно использовать обычные хроматографические трубки. Успех всякого разделения на распределительной колонке с целлюлозой зависит от четкости границ зон и объемного разделения между зонами. Четкость границ возрастает, если диаметр колонки уменьшается. Объемное разделение между зонами улучшается при возрастании высоты колонки. Но по мере того как высота колонки возрастает и уменьшается ее диаметр, уменьшается и количество материала, которое можно разделить на колонке, возрастает капиллярное сопротивление и уменьшается скорость потока жидкости, орошающей колонку. Эмпирически найдено, что соотношение высоты и диаметра колонки должно быть равно 9:1. Количество вещества, которое можно ввести в колонку, зависит от легкости разделения компонентов. Загрузка для каждого индивидуального компонента приблизительно пропорциональна величине его.

Наполнение колонки является наиболее важной при проведении хроматографии на целлюлозе. На фарфоровый фильтровальный диск, который служит дном обычной хроматографической колонки, вначале помещают либо кусочки фильтровальной бумаги, либо стеклянное волокно. После этого в колонку загружают промытый водой и высушенный стандартный порошок целлюлозы. Для заполнения колонки можно применять сухой порошок целлюлозы, суспензию целлюлозы. Для приготовления суспензии обычно используют ацетон. Порошок целлюлозы смешивают с ацетоном в гомогонизаторе Уоринга до тех пор, пока не получится однородная суспензия средней консистенции. Полученную суспензию переносят в стеклянную трубку. Ацетон стекает через дно трубки, а суспензию медленно перемешивают стеклянной палочкой как раз над линией оседания для равномерного заполнения трубки и чтобы предупредить образование трещин. Хроматографическая трубка все время должна быть почти доверху заполнена суспензией. Когда колонка заполнена на нужную высоту, ацетону дают стечь, тщательно следят за тем, чтобы не обнажалась поверхность целлюлозы. Сверху на слой целлюлозы помещают кусочек пористой фильтровальной бумаги. После этого колонку в течение нескольких дней тщательно промывают растворителем, который будет применяться для орошения колонки при хроматографировании. Колонка должна быть всегда заполнена жидкостью, так как, если она стечет или испарится, объем целлюлозы может уменьшиться и у стенок трубки могут образоваться зазоры. Когда растворитель проходит через колонку, частички целлюлозы поглощают воду и разбухают, образуя плотный слой. Плотность заполнения определяется консистенцией применяемой суспензии. Если суспензия слишком жидкая, набивка будет слишком плотной и возможно частичное фракционирование целлюлозы по размерам частиц.

Если нужно приготовить колонку для хроматографирования с большей скоростью потока, при заполнении ее вместо ацетона можно применить более вязкий растворитель н-бутанол. Для колонок с менее плотной набивкой некоторые исследователи предпочитают готовить суспензию на том же растворителе, который будет применяться для колонки при хроматографировании.

При работе с препаративными колонками, в частности с колонками значительной высоты, в тех случаях, когда желательно увеличить скорость тока раствора, лучше применять избыточное давление. Применение вакуума в последнем случае часто приводит к уменьшению количества растворителя в нижней части колонки и последующему нарушению разделения в этой зоне.

Равномерность заполнения колонки можно проверить, пропуская через нее раствор красителя, например метилрота, в растворителе, который будет применяться. Для этого растворителю дают стечь с верха колонки, после чего добавляют из медицинской капельницы приготовленный раствор красителя, равномерно распределяя его по поверхности целлюлозы, а затем вымывают растворителем, возвращая на место резервуар с растворителем, как только окрашенная зона начнет двигаться вниз вдоль колонки. Если краситель движется вдоль колонки как горизон-тальная окрашенная зона, колонка заполнена равномерно и годна к употреблению. Если окрашенная зона движется неровно, колонка заполнена неправильно и ее нужно заполнить снова.

Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6